Stratégie n°1 : utilisation de séquences répétitives B1 et B2

Le principe de cette stratégie est l’utilisation de séquences répétitives au sein de l’ADN géno- mique qui fourniront un point d’ancrage pour l’amplification associés à une séquence spécifique de l’ADN plasmidique intégré. Les trois principaux groupes de séquences répétées dispersées sur l’ADN génomique sont les microsatellites, les SINE (Short INterspersed Elements, éléments de quelques centaines de nucléotides) et les LINE (Long INterspersed Elements, éléments de plu- sieurs milliers de nucléotides). Les éléments SINE sont des éléments mobiles de l’ADN dérivés des gènes de petits ARN, transcrits par l’ARN polymérase III : ARNt et ARN 7SL. Des familles de SINE ont été identifiées dans de nombreux organismes animaux invertébrés, vertébrés ou vé- gétaux. Les exemples de SINE les mieux connus sont l’élément Alu chez l’homme et les éléments B1 et B2 chez la souris. Ces séquences B1 et B2 (tout comme la séquence Alu chez l’homme) présentent un grand intérêt pour la détection de sites d’intégration car elles sont situées dans des régions favorables à la recombinaison. Nous avons choisi d’utiliser ces deux éléments B1 et B2 (longs d’environ 150 bases) : sachant qu’il y a environ 564 000 copies de l’élément B1 et 348 000 copies de l’élément B2 dans le génome de souris constitué de 2,5.109 _{bases on peut considérer}

qu’en moyenne deux éléments B1 et/ou B2 sont distants de 2,7kb [366]. Un événement d’inté- gration aléatoire se trouve donc en moyenne à 1,3kb de deux éléments B1 et/ou B2. Il est donc théoriquement possible dans des conditions de PCR adéquates d’amplifier un fragment d’ADN avec une amorce spécifique du plasmide d’intérêt et une amorce spécifique d’un des éléments B1 ou B2. Il existe au total 16 combinaisons possibles d’intégration d’un plasmide entre deux séquences B1 et/ou B2, et tous ces cas sont envisageables (figure4.3) avec la même probabilité.

B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1 B1 GFP B2 B1 GFP B1 B2 GFP B2 B2 GFP B1

Fig.4.3 – Différentes configurations possibles d’intégration d’un plasmide entre deux séquences B1 et/ou B2.

172 Chapitre 4. Etude de l’état de l’ADN plasmidique après injection et électrotransfert Pour mettre au point cette technique, nous avons travaillé sur l’ADN génomique extrait des cellules de deux lignées stables NIH/3T3-GFP distinctes. Pour réaliser ces lignées, le plasmide pEGFPC1 a été digéré par l’enzyme de restriction DraIII (coupure unique), puis mis en incu- bation avec des cellules NIH/3T3 avant électroporation. Dans chacune de ces lignées, le gène de la GFP a été intégré en une copie unique (lignées stables réalisées par Dr. Virginie Escriou au laboratoire). Le principe de cette technique est donc de réaliser une double PCR nichée, c’est-à-dire deux PCR successives en utilisant pour la deuxième PCR des amorces spécifiques du fragment amplifié par la première PCR, pour augmenter la spécificité de l’amplification : la première PCR est réalisée avec une amorce spécifique du gène de la GFP (EGFPN ou EGFPCC) et une amorce spécifique d’un élément B1 ou B2 (B1N, B1C ou B2N, B2C), la deuxième PCR est réalisée avec une amorce spécifique du gène de la GFP (EGFPCN ou EGFPC selon la première amorce choisie) et toujours une amorce spécifique d’un élément B1 ou B2 (B1N, B1C ou B2N, B2C) (figure 4.4).

B1N

B1 GFP B2 B1 B2

Lignée stable n°1 Lignée stable n°2

B1N EGFPN EGFPCC B2C B2C Première PCR Deuxième PCR (nichée) EGFPCN EGFPC B1N-EGFPCC EGFPN-B2C ou B1N-EGFPC EGFPCN-B2C ou GFP EGFPN EGFPCC EGFPCN EGFPC B1N B1 GFP B2 B1 B2

Lignée stable n°1 Lignée stable n°2

B1N EGFPN EGFPCC B2C B2C Première PCR Deuxième PCR (nichée) EGFPCN EGFPC B1N-EGFPCC EGFPN-B2C ou B1N-EGFPC EGFPCN-B2C ou GFP EGFPN EGFPCC EGFPCN EGFPC

Fig. 4.4 – Stratégie n°1 : utilisation de séquences répétitives B1 et B2 _{Amplifications en}

parallèle sur l’ADN de deux lignées stables. Amorces utilisées : B1N : 5’gtctacatagtgagttccga3’, B1C : 5’tcggaactcac- tatgtagac3’, B2N : 5’tctgaagacagctacagtgta3’, B2C : 5’tacactgtacctgtcttcaga3’, EGFPN : 5’tggtgagcaagggcgagg3’, EGFPC : 5’cctcgcccttgctcacca3’, EGFPCN : 5’catcgaggacggcagcgt3’, EGFPCC : 5’acgctgccgtcctcgatg3’

Nous avons travaillé sur l’ADN des deux lignées en parallèle pour pouvoir comparer les résultats et ainsi détecter toute amplification non spécifique : en effet il n’y a aucune raison que le gène de la GFP soit intégré au même endroit sur les deux échantillons, il n’y a donc aucune raison d’amplifier des fragments de même taille sur les deux échantillons, sauf s’il s’agit

4.3. Etude de la possible intégration de l’ADN plasmidique 173 d’amplification non spécifique du plasmide comme par exemple des amplifications B1-B1 ou B2-B2 selon l’amorce choisie.

Pour un premier essai nous avons pris comme hypothèse de travail que l’intégration avait eu lieu selon le profil suivant : élémentB1-GFP-élémentB2 (ce cas est celui représenté figure 4.4). C’est bien sûr une hypothèse de travail mais en théorie toutes les combinaisons devraient être testées. Nous avons donc effectué d’une part une PCR avec les amorces B1N et EGFPCC et une deuxième PCR sur le produit de la première avec les amorces B1N et EGFPC, et d’autre part une PCR avec les amorces B2C et EGFPN et une deuxième PCR sur le produit de la première avec les amorces B2C et EGFPCN. Chaque PCR a été reproduite sur les deux échantillons d’ADN issus des deux lignées stables. Le programme de PCR utilisé est dans tous les cas : 95°C 5min-58°C 5min-35 cycles (95°C 30s-58°C 45s-72°C 2min)-72°C 5 min.

Cette stratégie n’a pas fonctionné : nous avons chaque fois amplifié des bandes non spécifiques que nous avons retrouvées de façon identique pour les deux échantillons alors que le gène de la GFP est intégré à des endroits distincts. Il est très probable qu’étant donné la fréquence des éléments B1 et B2 dans le génome de souris, nous avons principalement généré des fragments de PCR B1-B1 ou B2-B2. Il faut noter que nous n’avons testé qu’une configuration d’intégration parmi les 16 possibles. Cependant nous avons décidé d’abandonner cette stratégie qui manque de spécificité au profit d’une autre stratégie plus sensible.