Première mise au point : effet de la hyaluronidase

L’imagerie optique permet de suivre l’expression d’un gène d’intérêt à long terme sur le même animal. Pour illustrer ce point nous avons réalisé un suivi de l’expression de la GFP pendant 169 jours après injection et électrotransfert de 50µg de plasmide dans le muscle tibial cranial sur une souris C57Bl/6. Brièvement, à différents temps après l’injection, la souris est anesthésiée, sa patte est rasée puis la souris est placée sous la caméra CCD avec une lumière d’excitation de 470nm. La lumière émise en dessous de 515 nm est éliminée par un filtre d’émission passe-haut placé au dessus de la source fluorescente. L’acquisition est réalisée pendant 0,1 seconde (figure 1.6). Les résultats de la cinétique sont présentés en fausses couleurs.

2 jours 7 jours 30 jours 31 jours 87 jours 108 jours 169 jours 2 jours 7 jours 30 jours 31 jours 87 jours 108 jours 169 jours

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Fig. 1.6 – Suivi de la cinétique d’expression de la GFP après injection et électro- transfert du plasmide pEGFP-C1.A. Photo de la souris avec la zone du muscle encadrée. B. Images en fausses couleurs du muscle transfecté au cours du temps (code de couleur : du bleu au rouge en fonction d’une intensité croissante).

L’expression de la GFP est bien visible dans les fibres musculaires. Cette expression s’estompe progressivement au cours du temps mais est toujours détectable à 169 jours.

1.6

Première mise au point : effet de la hyaluronidase

Le muscle squelettique est constitué de faisceaux musculaires formés eux-mêmes d’un en- semble de fibres musculaires, entourés de tissu conjonctif : lors d’un transfert de gène, l’ADN doit franchir de nombreuses barrières biologiques avant de parvenir au noyau des cellules cibles. Les principales macromolécules constituant la matrice extracellulaire sont des polysaccharides (glycosaminoglycanes et protéoglycanes) et des protéines fibreuses de structure (collagènes et élastine) ou d’adhérence (fibronectine et laminine), jouant un rôle important dans les interactions cellule-cellule et cellule-matrice.

L’acide hyaluronique (figure 1.7) est un des principaux glycosaminoglycanes présents dans la matrice extracellulaire, il est caractérisé par une longue chaîne unique de plusieurs milliers de résidus sucrés, sans groupements sulfate. De nombreuses protéines extra-cellulaires de la matrice (collagène, fibronectine, laminine) ainsi que des récepteurs cellulaires de surface (comme le CD 44) peuvent se lier à l’acide hyaluronique.

La hyaluronidase est une enzyme responsable de la dégradation de l’acide hyaluronique : elle est impliquée dans sa dépolymérisation et son hydrolyse. Cette enzyme est utilisée pour augmenter le transfert de gène par des lipides cationiques dans le foie [283] ou dans des chondro- cytes [284], elle est également utilisée pour améliorer le transfert de gène viral par des AAV [106]. Favre et al. ont en effet montré qu’un prétraitement à la hyaluronidase (100U/250µl, 3 heures

86 Chapitre 1. Suivi du transfert de gène par imagerie optique

Fig.1.7 – Structure de l’acide hylauronique.

avant) d’un muscle de rat permettait d’augmenter la diffusion d’un AAV dans le tissu conduisant une expression deux à trois fois plus élevée, sans toxicité apparente [106].

La hyaluronidase permet ainsi d’augmenter l’accessibilité du gène d’intérêt aux cellules cibles en détruisant partiellement la matrice extracellulaire : les zones transfectées sont plus étendues avec un niveau d’expression plus élevé. Cette enzyme a été utilisée récemment avec efficacité combinée à l’électrotransfert intramusculaire [105, 108, 172].

La mise au point d’un protocole optimal d’électrotransfert nécessite de trouver un équilibre entre un niveau d’expression élevé (lié au voltage nécessaire) et des dommages induits limités. Selon l’application souhaitée cet équilibre penchera plus vers l’un ou l’autre des paramètres. Par exemple, quand le but de l’électrotransfert est la production en systémique d’une protéine à long terme (mEpo, facteur IX) ou surtout l’induction d’une réaction immune (vaccination génétique), les dommages causés ne sont pas forcément gênants : un muscle sain récupère rapidement d’un dommage lié à l’électrotransfert par activation des cellules satellites et fusion de myoblastes pour régénérer les fibres musculaires. Par contre dans le cas du traitement de maladies telles que la dystrophie où les muscles sont fragiles, il est indispensable d’avoir une survie des fibres musculaires tout en optimisant le nombre de fibres transfectées [172].

La hyaluronidase permet donc dans certains cas de réduire le voltage utilisé, et ainsi de limiter le dommage musculaire, tout en garantissant un haut niveau d’expression. McMahon et al. ont montré lors d’un électrotransfert intramusculaire que l’injection de hyaluronidase n’induisait pas de dommage [108].

Dans notre cas nous souhaitons utiliser la hyaluronidase pour optimiser la capacité de pro- duction du muscle et la capacité de sécrétion de protéines (voir chapitre 3). Le but est, à voltage (et donc à dommage) égal de maximiser la production de protéines.

1.6.2 Mise en oeuvre

Nous avons voulu étudier par imagerie optique l’effet d’un prétraitement à la hyaluronidase sur l’expression d’un transgène après électrotransfert. Pour cela, nous injectons 25µl de hyaluronidase (0,4 U/µl) dans le muscle tibial cranial de 4 souris SWISS. Deux heures après ce prétraitement, 30µg de plasmide pEGFPC1-luc sont injectés et électrotransférés dans le muscle tibial cranial de ces mêmes souris. En parallèle, 4 autres souris SWISS reçoivent également 30µg de plasmide pEGFPC1-luc sans prétraitement. Une semaine après les souris sont anesthésiées et placées sous la caméra CCD. Des mesures de luminescence sont effectuées après injection en local dans le muscle de 100µg de luciférine dans 40µl de PBS. Deux heures après, les souris sont sacrifiées, les muscles sont récupérés et visualisés en fluorescence (figure 1.8).

Que ce soit en luminescence ou en fluorescence, on observe une expression beaucoup plus élevée lors d’un prétraitement à la hyaluronidase. Les images en fluorescence nous permettent de constater que la zone transfectée est plus étendue avec un plus grand nombre de fibres transfec- tées.