Validation des cibles potentielles

Suite au criblage des macrophages humain, plusieurs protéines ont causé une modulation de l'infection virale, soit à la hausse ou à la baisse. Étant donné qu'un criblage privilégie la quantité à la qualité des résultats, ceux ayant eu un effet significatif ont été validés par diverses méthodes. Tout d'abord, la cytométrie de flux est beaucoup plus sensible que le lecteur de plaque et permet aussi d'avoir la fluorescence cellule par cellule et de voir la proportion de cellules infectée au lieu de la fluorescence moyenne d'un puits. La viabilité cellulaire va aussi être analysée pour les siRNAs ayant diminué l'infection afin de s'assurer que cette baisse est bien causée par l'ARN interférent et non par une mort cellulaire. L'efficacité des siRNAs sera aussi vérifiée sur la quantité d'ARNm dans la cellule et l'expression des protéines pour pouvoir associer la modulation de l'infection à l'absence de la protéine.

3.4.1. Cytométrie de flux

Pour vérifier le taux d'infection par cytométrie de flux, les MDMs ont été transfectés cette fois dans des plaques 24 puits hydrophobiques (Sarstedt) pour faciliter le détachement des cellules et éviter de les abîmer. Le protocole de transfection est semblable à celui de la section 3.3.1, à l'exception que la concentration finale des siRNAs est de 20 nM et que 200 000 cellules sont transfectées par puits.

Suite à une infection de 6 jours avec le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA, les cellules sont mises dans 1 ml de PBS comprenant 5 mM d'EDTA et 1% de BSA. Suite à une incubation de 60 minutes à 37°C sous 5% de CO2, les MDMs sont prêts à être détachés. Un petit grattoir

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stérile est utilisé pour décoller les cellules. Celles-ci ont été transférées dans des tubes pour cytométrie (Thermo Fisher Scientific). Après 2 lavages de PBS 1X- EDTA 5 mM, les cellules sont marquées avec le Fixable Viability Dye eFluor®780 (eBioscience) pendant 30

minutes à 4°C, puis lavées 2 fois. Ceci permettra de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes au cytomètre de flux. Les récepteurs Fc, fortement présents à la surface des MDMs, sont bloqués pendant 30 minutes à 4°C avec un tampon de blocage contenant du DPBS 1X, 5 mM d'EDTA, 1% de BSA, 20% de NGS (Normal Goat Serum) (Fitzgerald Industries International,) et 10% de sérum humain AB ayant été filtré à 0.22 µm. L'anticorps dirigé contre le HSA (CD24) murin couplé au fluorophore PE (eBioscience) a été utilisé pour marquer les cellules infectées productivement, soit 0.5 µL d'anticorps par tube dans un total de 150 µL de tampon de blocage. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps pendant 15 minutes à 4°C, puis lavées 2 fois au PBS-EDTA-BSA. Finalement, les MDMs ont été fixés avec une solution de 4% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à 4°C, lavés 2 fois et résuspendus dans du PBS-EDTA. Les cellules sont fixées afin d'inactiver les particules virales et ainsi pouvoir sortir les tubes du NC3 pour la cytométrie de flux.

La lecture de la fluorescence a été faite avec un appareil FACS Canto (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) et l'analyse des résultats avec le logiciel FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Un tube non infecté, mais marqué avec l'anticorps contre HSA a été utilisé pour mesurer le bruit de fond et les résultats pour les divers siRNAs utilisés ont été comparés à la moyenne des siRNAs contrôles.

3.4.2. Extraction d'ARN et PCR quantitative

Pour vérifier le niveau d'ARNm d'un gène précis suite à son interférence par ARN, 200 000 MDMs ont été transfectés avec le siRNA d'intérêt pendant 24 ou 72 heures, puis les cellules ont été lavées une fois au DPBS et mises dans 1 ml de TRIzol (Thermo Fisher Scientific) pour lyser les cellules. Le lysat a été centrifugé dans un tube phase-lock (5 Prime GmbH, Hilden, Allemagne) suite à l'ajout de 1-bromo-3-chloropropane (Sigma-Aldrich, Saint- Louis, MO) pour isoler la phase contenant les ARN totaux. L'ARN a ensuite été extrait de cette phase avec l'ensemble d'extraction Nucleospin (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne).

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De l'ADN complémentaire (cDNA) a été synthétisé avec une RT-PCR (reverse

transcription polymerase chain reaction) à partir de 500 ng d'ARNm. La RT-PCR a été

faite en utilisant la transcriptase inverse provenant du virus de la leucémie murine (M-MLV RT, Promega, Madison, WI) et des random primers (Sigma) pour obtenir une banque d'ADN complémentaire complète dans un même tube. Ces cDNA ont ensuite été testés par PCR quantitative (qPCR) (modèle ABI 7500, Thermo Fisher Scientific) en utilisant le Power SYBR® Green (Thermo Fisher Scientific) et une dilution appropriée de cDNA, habituellement 1/20. Les gènes testés ont tous été normalisés sur le 18S comme contrôle interne.

3.4.3. Immunobuvardage

Afin d'avoir un nombre élevé de protéines, 800 000 MDMs ont été transfectés avec les siRNAs contrôles ou spécifiques aux cibles potentielles dans des plaques 6 puits. Suite à une incubation de 24 ou 72h, les cellules ont été lysées dans 150 µL de tampon de lyse T8 (Urée 7M, Thio-urée 2M, 3% de détergent CHAPS, DTT 20 mM, TCEP 5mM, 0,5% IPG pH 4-7 et 0,25% IPG pH 3-10) auquel du Tris a été ajouté pour une concentration finale de 50 mM ainsi que des inhibiteurs de protéases. Pour certaines protéines, les cellules ont été prétraitées avant la lyse avec du MG132 à une concentration de 10 µM, un inhibiteur des protéasomes, pendant 6h. Le lysat a été centrifugé 5 minutes à 17 000 G et le surnageant a été transféré dans un nouveau tube pour éliminer les débris cellulaires, puis congelés à - 80°C.

Pour effectuer l'immunobuvardage, 30 µg de protéines contenant du Laemmli 1X (Bio-Rad, Hercules, CA) auquel du β-mercaptoéthanol a préalablement été ajouté ont été mis par puits d'un gel de polyacrylamide. Suite à la migration, les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (Millipore), qui a ensuite été bloquée dans du TBS 1X (Tris-buffered

saline) comprenant du Tween-20 et 5% de protéines de lait. La membrane a été marquée

avec l'anticorps anti-MDM2 (clone 2A10, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et anti-actine (clone I19, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX), puis avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA et Santa Cruz Biotechnology, Inc.). La membrane a été incubée avec de l'ECL (Western

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Lightning Plus, Perkin Elmer, Waltham, MA) pendant 1 minute avant l'exposition sur un film.

3.4.4. Cinétique de production virale

Pour mesurer l'impact des siRNAs sur la production de nouvelles particules virales, 200 000 MDMs ont été transfectés dans une plaque de 24 puits pendant 24 ou 72h. Les MDMs ont ensuite été infectés avec le virus NL4-3-Bal à une MOI de 0.1 pendant 2h à 37°C sous 5% de CO2. Après l'incubation, les puits ont été lavés 2 fois avec du DPBS pour

retirer le virus et le remplacer par 1ml de RPMI-10% AB-HS, question de ne pas doser le virus que nous avons utilisé pour l'infection. Les cellules ont été incubées sur une période de 12 jours et la moitié du surnageant a été récolté à tous les trois jours suivant l'infection et le même volume de milieu frais a été ajouté après chaque prélèvement. Au 12e _{jour, un test}

de PMS-MTS (CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) a été effectué sur les cellules pour mesurer leur métabolisme. Ce test colorimétrique nous permet de vérifier s'il y a une différence dans le métabolisme des cellules, ce qui pourrait influencer la production de p24. Les surnageants ont tous été congelés à -20°C jusqu'au dosage par ELISA p24, tel qu'indiqué à la section 3.1.5.1.