Identification de protéines régulatrices du VIH-1 chez les macrophages humains

Suite à l'analyse des profils protéomiques et transcriptomiques de macrophages infectés et de la population réfractaire au VIH-1 (bystander), plusieurs gènes ont été sélectionnés pour un criblage de petits ARN interférents. Les cibles ont été choisies parmi les résultats les plus significatifs et reproductibles, en prenant soins de représenter plusieurs catégories de fonctions du macrophage. Ces gènes sont régulés à la hausse ou à la baisse chez les cellules infectées, montrant une certaine importance pour le cycle viral. Nous voulions donc vérifier si la protéine correspondante était importante pour l'établissement de l'infection chez les macrophages. L'interférence par ARN semblait donc un moyen rapide et efficace pour diminuer spécifiquement l'expression d'un gène et vérifier son importance dans le cycle viral.

Les MDMs de 6 donneurs ont été transfectés avec un siRNA contrôle (similarité limitée avec des séquences humaines) ou dirigé contre l'un des 50 gènes sélectionnés, puis infectés avec le virus NL4-3-BAL-IRES-eGFP ou NL4-3-BAL-IRES-FireflyLuc pendant 3 ou 6 jours avant de lire le signal de fluorescence ou de bioluminescence (voir Figure 10). Les contrôles de régulation positive et négative ont bien modulé le signal, soit une augmentation d'au moins 50% pour le siSAMHD1 et une diminution de 80% pour le siCD4. Plusieurs cibles ont montré une modulation de l'intensité du signal. La majorité des cibles ont rendu les MDMs plus susceptibles aux VIH-1 et sont donc des régulateurs négatifs de l'infection, tandis que quelques cibles semblent être des régulateurs positifs. Parmi les gènes testés, 8 montrent une modulation importante pour les 2 séquences de siRNAs utilisés tout en étant reproductibles d'un donneur à l'autre (voir Tableau 1). Ces gènes ont ensuite été analysés pour vérifier que l'interférence par ARN induit bel et bien une diminution du niveau d'ARNm dans les MDMs au moment de l'infection.

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Figure 10: Criblage de petits ARN interférents des gènes modulés par le VIH-1 révèle de nouveaux régulateurs de la réplication virale chez les macrophages

Les MDMs ont été transfectés avec un siRNA contrôle ou dirigé vers l'un des 50 gènes criblés, puis infectés avec le virus NL4-3-Bal-IRES-eGFP (MOI: 0.1). L'intensité de la fluorescence a été mesurée dans un lecteur de plaques 96 puits. Les données sont normalisées sur la fluorescence moyenne des siRNAs contrôles. Chaque point correspond à la fluorescence moyenne normalisée de 6 donneurs différents. Les points bleus représentent le siRNA CD4 (contrôle de facteur de susceptibilité) et les points rouges sont le siRNA SAMHD1 (contrôle de facteur de restriction). Chaque point représente la transfection des MDMs par un siRNA spécifique. Les points orange sont les cibles ayant eu les résultats les plus significatifs et reproductibles. Une expérience similaire a été effectuée avec le virus codant pour la Firefly-Luc, montrant des résultats semblables.

40 Tableau 1: Gènes modulant l'infection par le VIH-1 Informations provenant du site internet de GeneCards [152].

4.1.2. Efficacité des petits ARN interférents

La transfection de certains siRNAs a modulé le taux d'infection des MDMs. Cependant, nous devons nous assurer que cette modulation est causée par le siRNA. Le niveau d'ARNm pour le gène correspondant au siRNA a donc été vérifié pour les 8 cibles suite à la transfection. Des MDMs ont été transfectés soit avec le siRNA contrôle ou le siRNA spécifique pendant 72h, puis l'ARN a été extrait des cellules. L'ARN a été quantifié à l'aide d'une RT-PCR quantitative pour l'ARN ribosomique 18S et le gène ciblé par le siRNA. La quantité d'ARNm pour le gène testé est normalisée sur celle du 18S, un gène dont l'expression est stable dans les cellules. Ceci assure que les modulations ne soient pas causées par un nombre de cellules légèrement différent dans les 2 conditions comparées. Le temps de transfection a été fixé à 72h pour vérifier si l'expression du gène est toujours affectée chez les MDMs au moment où les cellules étaient infectées lors du criblage. L'expression des gènes ADAR1, APOBEC3B, ATM, GGH, LOXL3 et OAS1 est toujours basse lors de l'ajout du virus (voir Figure 11). Par contre, le niveau basal de transcrits pour

FABP9 est faible et les valeurs obtenues sont très variables. Pour MDM2, il n'y a pas de

Gène Protéine Fonction

ADAR1 Adenosine Deaminase, RNA-Specific Édite les adénosines en inosines _{sur un ARN double brin}

APOBEC3B Apolipoptrotein B mRNA Editing Enzyme _{Catalytic Subunit 3B} Induis des hypermutations G→A _{sur l'ADN viral}

ATM ATM Serine/Threonine Kinase Senseur de dommages à l'ADN, _{régule le cycle cellulaire}

FABP9 Fatty Acid Binding Protein 9 Inconnue

GGH Gamma-Glutamyl Hydrolase Métabolisme de l'acide folique

LOXL3 Lysyl Oxidase Like 3 Oxyde les amines de différents _collagènes

MDM2 MDM2 Proto-Oncogene _{plusieurs protéines dont p53} E3 ubiquitin ligase régulant

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baisse significative de l'expression à 72h post-transfection, mais des temps plus courts ont montré une diminution efficace à 24h post-transfection (voir Figure 16).

Figure 11: Efficacité des siRNAs sur le niveau d'ARNm

Les MDMs ont été transfectés avec le siRNA (20 nM) pendant 72h, puis l'ARN a été extrait et analysé en triplicata par RT-PCR quantitative. Le niveau d'ARNm pour le gène est d'abord normalisé sur celui du 18S, puis sur la moyenne des siRNAs contrôles. La diminution de l'ARN est significative pour ADAR1, APOBEC3B, ATM, GGH, LOXL3 et OAS1, mais pas pour FABP9 et MDM2 (two-way ANOVA with Sidak’s multiple

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