I.3 Conception de ligands protéiques
I.3.3 Utilisation de plateformes naturelles
Une autre alternative réside dans l’utilisation de plateformes naturelles, mettant ainsi à profit la diversité structurale existante dans la nature. Ces informations structurales sont disponibles, en partie, dans les bases de données de structures protéiques (annexe A.2). La conception de ligands protéiques peut être alors envisagée par le transfert d’un motif fonctionnel sur une plateforme naturelle appropriée, de structure connue.
Les premiers exemples de transfert de motifs correspondent à la construction de protéines « chimères », dans lesquelles des segments de séquence entiers sont échangés entre deux protéines appartenant à deux espèces différentes, mais dont le repliement local ou global est similaire. Par exemple, la boucle centrale de la toxine α de serpent a été transférée sur la charybdotoxine, certes, de taille inférieure, mais présentant un repliement en épingle à cheveux identique [111, 112]. La protéine chimère ainsi créée est illustrée sur la figure I-23.
Figure I-23 : Création d’une protéine chimère, capable de lier le récepteur à acétylcholine, après le transfert de la boucle de liaison de la toxine α [111].
La protéine chimère obtenue et la toxine α de serpent lient, toutes deux, le récepteur à acétylcholine avec des affinités respectives de l’ordre de 10-5 M et 10-9 M. Le transfert de 9
résidus sur une plateforme structurale similaire, a permis de transférer une partie de l’activité biologique.
Le même type d’approche a été réalisé par le transfert d’éléments de structure secondaire sur une plateforme dont le repliement global est différent. La protéine PF4 est constituée de 5 brins β et de 2 hélices α. Les déterminants de l’interaction ne sont portés que par les deux hélices α distantes en séquence. Or, la structure « leucine zipper » de la protéine GCN4, formée de deux hélices uniquement, permet de disposer le motif de liaison dans une topologie similaire. Ainsi, la capacité de lier l’héparine de la protéine PF4 a-t-elle été transférée sur la protéine GCN4 [113], illustrée sur la figure I-24. L’activité de liaison, mesurée par la rétention sur une colonne d’héparine-agarose, a montré un comportement similaire entre la protéine PF4 et la protéine GCN4 modifiée. La même protéine GCN4, a été utilisée pour porter le motif de liaison de l’interleukine 4 pour son récepteur [114], également illustré sur la figure I-23. Les affinités mesurées varient de 2 mM à 5 µM selon la fraction du site fonctionnel transféré.
Figure I-24 : Conception de mimes protéiques des protéines PF4 [113] et interleukine 4 [114], en utilisant la même plateforme structurale : la protéine GCN4. Les protéines PF4 et IL-4 présentent des repliements différents, toutefois, les résidus impliqués dans la liaison sont portés par des éléments de structure secondaire identiques.
Ces deux travaux démontrent qu’un même repliement est capable de supporter deux activités biologiques, différentes selon le motif de liaison transféré.
De façon similaire, plusieurs travaux ont été réalisés dans le but de concevoir des protéines liant l’ADN ou diverses surfaces protéiques [115]. L’approche proposée de greffe sur protéine (« protein grafting ») comprend, dans un premier temps, le transfert d’un épitope fonctionnel, présent sur des éléments de structure secondaire type hélice α ou hélice polyPro type II, sur la structure du polypeptide pancréatique aviaire aPP. Cette mini-protéine de 36 résidus, constituée d’une hélice polyPro type II, d’un coude β de type I et d’une hélice α est, malgré sa faible taille, très bien structurée [1PPT, 116]. Dans un second temps, les propriétés de liaisons des protéines
ainsi greffées sont optimisées par la réalisation de banques de phages. La mise en application de cette approche, schématisée figure I-25, a permis la conception de plusieurs ligands d’affinité comprise entre µM et nM, après optimisation : ligands de protéines impliquées dans les processus de cancérogenèse, hDM2 [115] et Bcl2 [117], ligands de sites spécifiques de l’ADN, site QRE [118] et site CRE [119, 120, 121].
Figure I-25 : Approche de conception par greffe sur protéine. L’exemple montré correspond à la conception d’un ligand de la protéine Bcl2. [117].
Plusieurs exemples, décrits dans la littérature, illustrent le transfert de sites de liaison sur d’autres éléments de structure secondaire divers, boucles [122] ou feuillets β [123, 124, 125, 126]. Ces derniers travaux notamment, concernent l’inhibition de l’entrée du virus HIV-1 dans les cellules du système immunitaire présentant le co-récepteur CD4. Lorsque le virus est à l’état circulant, la protéine gp120 n’est pas exposée en surface et, de ce fait, ne constitue un déterminant antigénique. En présence de la protéine CD4, la protéine gp120 est démasquée. La stratégie envisagée repose sur l’utilisation d’un mime de la protéine CD4 afin de démasquer la protéine gp120 avant l’entrée du HIV-1 dans les cellules immunitaires. Les épitopes de la protéine gp120 ainsi exposées favoriseraient une réponse immunitaire. La protéine CD4 interagit avec la gp120 par l’intermédiaire d’un feuillet composé de deux brins β anti-parallèles, comme indiqué sur la figure I-26, A.
Figure I-26 : Conception de mini-CD4, ligand de la protéine gp120 à partir de la scyllatoxine. La protéine gp120 a été cristallisée en interaction avec la protéine CD4 et CD4M33, ces deux dernières présentant un mode de liaison similaire. [125, 127].
Un élément de structure secondaire identique a été identifié dans la scyllatoxine, petite protéine de 28 résidus dont la structure est stabilisée par 3 ponts disulfures. Les deux structures présentent une grande similarité (RMSD calculé sur la chaîne principale de 1,1 Å). Le transfert des résidus considérés comme important pour la liaison, a permis d’obtenir un mini-CD4, utilisé comme molécule guide [125]. A partir de cette dernière, plusieurs modifications ont été effectuées. L’un des premiers variants de la scyllatoxine, CD4M3, présentait une affinité de 40 µM. Après plusieurs étapes, l’optimisation de la molécule guide initiale a abouti à la protéine CD4M33, d’affinité 7,5 nM pour la gp120, soit une amélioration d’un facteur 5000. Les séquences des différents variants sont montrées sur le tableau I-27. En outre, la structure du complexe gp120-CD4M33 [127] résolue par radiocristallographie a permis de valider le mode de liaison supposé (figure I-26, B).
Protéine Hélice α1 Brin β1 Brin β2 Kd CDR2