De nos jours, un objectif de microscope performant est capable de focaliser la lumière sur une surface de moins d'un micron carré. Comme il vient d'en être question, cette particularité est très recherchée pour diminuer le volume d'analyse. Il faut remonter en 1976 pour trouver dans la littérature le premier usage de la microscopie pour la détection d'une faible quantité de fluorophore [59, 60]. Depuis, plusieurs en ont tiré profit [24, 29, 61].
2.4.1 Fonctionnement et avantages
En microscopie, la collecte de l'émission en épifluorescence est couramment rencontrée. Le schéma de la Figure 2.10 en présente le concept [29]. Le faisceau d'excitation traverse le filtre dichroïque et est focalisé à l'aide de l'objectif de microscope sur l'échantillon. À cette étape, toute l'épaisseur de l'échantillon est excitée selon la forme des deux cônes inversés, comme le volume non-confocal décrit sur la Figure 2.10. L'émission de fluorescence est isotrope et une partie des photons revient dans l'objectif. Puisque le filtre dichroïque placé à 45° est conçu pour être transparent à basse longueur d'onde (excitation) et pour réfléchir les hautes longueurs d'onde (émission), les photons de fluorescence sont dirigés vers le détecteur. Cette configuration est typique de l'épifluorescence. Il est important de souligner qu'un objectif de microscope avec une grande ouverture numérique (NA) améliore l'efficacité de collecte des photons de fluorescence en récoltant la lumière provenant d'un plus grand angle [62].
Excitation Filtre dichroïque Volume , «-•c^ confocal Volume noto-confocal » Plan focal Polymère avec fluorophores
Figure 2.10 : Principe de l'épifluorescence avec détection confocale
Dans un montage confocal, les photons sont focalisés dans une ouverture de quelques microns de diamètre appelée sténopé, avant d'atteindre le détecteur. Cette ouverture a pour fonction de rejeter tous les photons qui ne proviennent pas du plan focal de l'objectif. En effet, dans la mesure où l'objet à mesurer au plan focal est entouré de solvant, les photons émis sous le plan focal seront en théorie focalisés derrière le sténopé tandis que ceux émis au-dessus du plan de
détection auront commencé à diverger devant le sténopé. Dans ces deux cas, les photons seront discriminés par le sténopé et ne rejoindront pas le détecteur, et seuls ceux émis à partir du plan de détection seront collectés. Le volume confocal est donc beaucoup plus petit que le volume excité car il limite la collecte de la lumière à un seul plan très mince plutôt qu'aux cônes typiquement formés par l'objectif. La fluorescence des impuretés présentes dans la solution ou provenant du substrat microfluidique peut donc être réduite, ce qui se traduit par une augmentation du rapport signal/signal de fond.
Au point le plus étroit du faisceau, il est possible d'estimer le volume de détection en le comparant à un cylindre dont le diamètre est la largeur du point focal et dont l'épaisseur est liée à la taille du sténopé employé [63]. D'ailleurs, c'est précisément dans cette zone qu'on retrouve la plus grande densité d'énergie (mW/m2) et cette distribution d'énergie décroit
rapidement vers les extrémités de la zone d'analyse. Il est important de saisir que cette variation de puissance d'excitation affectera aussi l'intensité de la fluorescence en fonction des différentes trajectoires possibles des particules dans le volume sondé [28, 64].
2.4.2 Variante de la microscopie confocale : la prédivergence optique
Pour effectuer la détection optique en focus hydrodynamique, le faisceau d'excitation est placé de façon orthogonal au plan microfluidique. Il est crucial d'obtenir un focus hydrodynamique le plus étroit possible car l'empreinte du laser doit couvrir adéquatement toute sa largeur. Autrement, des particules analytes pourraient échapper au volume de détection et la distribution d'intensité de fluorescence ne serait pas uniforme [28, 63]. En effet, pour une empreinte laser deux fois plus large que le focus, l'écart-type relatif (ETR) sur la distribution d'intensité de particules fluorescentes atteint 12 % tandis qu'une empreinte cinq fois plus large améliore la distribution à 5 % d'ETR [64]. Toutefois, comme mentionné à la section 2.2, la largeur du focus est limitée par la géométrie des canaux et par le ratio des débits des liquides. D'ailleurs, il est difficile d'atteindre de manière durable des largeurs de focus inférieures au dixième de la largeur du canal de sortie [40]. Il est donc utile d'être en mesure de contrôler la taille de l'empreinte laser pour la moduler selon la largeur du focus optimal.
Une méthode originale de contrôle de la taille du faisceau d'excitation pour qu'il concorde avec la largeur d'une zone d'intérêt en milieu microfluidique a été suggérée par Boudreau et coll.
[65]. Dans leur approche d'épifluorescence, les auteurs provoquent la divergence contrôlée du faisceau d'excitation à l'aide d'une paire de lentilles divergente et convergente. Cette prédivergence se répercute en focalisant l'excitation plus loin dans l'axe optique que le plan de travail de l'objectif de microscope. Cependant, l'objectif collecte toujours la fluorescence au plan de travail pour lequel il a été conçu, et ce, peu importe le point où l'excitation est focalisée. On assiste donc à l'élargissement de la zone excitée au plan de travail de l'objectif. La Figure 2.11 a) montre la focalisation d'un faisceau laser par un objectif de microscope, pour un faisceau d'excitation collimaté. En b), le faisceau collimaté est d'abord divergé par une lentille négative puis ramené par une lentille positive pour entrer en entier dans la pupille de l'objectif. A titre indicatif, lorsque les focales de ces lentilles sont superposées, on obtient un faisceau collimaté dont le diamètre est accru. Cependant, dans le cas présent, la distance entre les lentilles est réglée de façon à créer volontairement de la divergence avant d'entrer dans l'objectif.
a)
b)
Laser collimé Objectif de microscope Point focal et Plan de détection Laser collimé Distance inter-lentilles Lentille divergente Lentille convergente Objectif de microscope \ ! ' \ \ i , Plan de detection '.il /Déplacement du point focal Point focal
Figure 2.11 : Conception optique pour la détection de fluorescence; a) pour un faisceau d'excitation collimaté; b) pour un faisceau d'excitation prédivergé
Au plan de détection de la fluorescence, on observe en b) que l'empreinte du faisceau d'excitation est plus large qu'au point de collecte car l'excitation n'a pas encore atteint son point focal situé plus loin sur l'axe optique. Par ailleurs, la distribution gaussienne de l'énergie du faisceau d'excitation fait en sorte que le centre de l'empreinte laser excite plus fortement les molécules que la périphérie du faisceau. En augmentant la taille du faisceau au plan de travail, on se trouve donc à diminuer l'irradiance, soit la puissance par unité de surface. Par contre, en respectant la condition de saturation optique et en récoltant seulement la fluorescence au centre de l'empreinte, on s'assure de collecter les photons des fluorophores qui auront été excités de façon uniforme, dans le sommet du profil gaussien de l'énergie d'excitation.