Chapitre 3: Matériel et méthodes
3.3 Composition des particules fluorescentes
L'intégration du système fluidique ainsi que la réalisation du système optique permettent d'étudier le déplacement de particules fluorescentes en focus hydrodynamique. En premier lieu, la validation du montage expérimental doit s'effectuer à l'aide de particules bien caractérisées. Pour se faire, des microparticules magnétiques commerciales ont été achetées pour ensuite être fonctionnalisées avec un fluorophore. La concentration de ces billes est connue et leur dimension est certifiée par le fabricant. Une fois le montage étalonné, des nanoparticules de type cœur-coquille ont pu être étudiées pour tenter de déterminer le facteur d'augmentation de la fluorescence attribuable à l'exaltation plasmonique. La présente section décrit les différents procédés de fonctionnalisation et de synthèse utilisés pour rendre les particules fluorescentes pour l'étalonnage du système et pour l'étude de nanoparticules cœur- coquille.
3.3.1 Fonctionnalisation de microparticules magnétiques
La compagnie Invitrogen offre une gamme de produits, DynaL qui est spécialisée dans la séparation de particules par champs magnétique. Les billes proposées dans cette série de produits sont en fait des particules cœur-coquille, dont le cœur est composé de nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques et la coquille est une mince couche de polystyrène sur lequel est greffé chimiquement de la streptavidine. La streptavidine est une protéine qui comprend quatre sites d'encrage pour la biotine, une petite molécule organique. L'association entre ces deux structures ne repose que sur les interactions de Van der Waals. Cependant, cette affinité est très forte avec une constante de dissociation, Kj, de 10"15 M [66]. Les particules
magnétiques peuvent donc être marquées avec une panoplie de fluorophores lorsque ceux-ci contiennent un groupement biotine. Il suffit de permettre aux billes magnétiques recouvertes de streptavidine d'interagir en solution avec des fluorophores attachés à des molécules de biotine. On sépare l'excès de fluorophores en attirant les billes au bas de la cuvette de mélange avec un aimant puis en retirant le surnageant.
Deux types de particules ont été utilisés dans le cadre de ce projet. Les premières possèdent un diamètre de 2,8 um (M-280) et les secondes un diamètre de 1,0 um (MyOne) (Invitrogen, 112.05D et 656.01). Les billes doivent être conservées entre 2°C et 8°C et sont suspendues dans un tampon phosphate contenant un peu d'azoture de sodium comme agent stabilisant. Le Tableau 3.1 énumère les différentes caractéristiques de ces billes, tel qu'elles sont fournies par le fabricant.
Paramètres M-280 MyOne
Diamètre
( C V < 3 % ) 2,8 um 1,0 fjm
Concentration
(/ mL contient 10 mg de billes) 6-7 x 108 billes/mL 7-12 x 108 billes/mL
Capacité de liaison
(1 mgde billes) 650-900 pmol biotine 1 100-1 700 pmol biotine
Le fluorophore choisi pour la fonctionnalisation de la surface est le Lucifer Yellow (LY). Il est lié à la biotine via une fonction cadavérine et on retrouve sa structure ainsi que son spectre d'excitation/émission en annexe (7 et 8) (Invitrogen, L-2601). Pour effectuer le greffage, la solution commerciale est d'abord homogénéisée au bain ultra-sons pendant cinq minutes. Ensuite, 20 uL de la solution sont prélevés. On décante les billes et on procède à deux lavages avec 100 uL de tampon TTL (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 % v/v Tween 20; 1 M LiCB. Les billes sont re-suspendues dans 100 uL de tampon TTL. À cette solution, on ajoute 20 uL d'une solution aqueuse 0,25 mM de LY-biotine. Le mélange est agité vigoureusement et laissé à reposer dix minutes à température pièce. Cette solution est décantée et lavée avec 20 uL de NaOH, 150 mM. Puis, les billes sont lavées deux fois avec 100 uL de tampon TTL et deux fois avec 100 uL de Tween 20, 0,1 % v/v. Finalement, les billes sont re-suspendues dans 100 uL de Tween 20, 0,1 % v/v. Ce mélange est prêt à être dilué pour analyse. Il est à noter que dans ce protocole, la concentration de LY-biotine est largement en excès par rapport à la streptavidine disponible à la surface des billes, et ce, peu importe le type de billes employé.
Dans le cas des billes M-280, on jauge cette solution fraîchement préparée à 1 mL avec de l'eau ultrapure. Par après, 100 uL sont prélevés et dilués à 500 uL. Cette nouvelle solution contient, selon les spécifications du fabricant, entre 1 200 et 1 400 billes pour un volume de 5 uL (volume de la boucle d'injection), soit en moyenne une bille par volume de 4 nL. Quant aux billes MyOne, la solution ci-haut préparée est amenée à 1 mL avec de l'eau ultrapure. On prélève 10 uL de cette nouvelle solution que l'on ramène à 1 mL, toujours avec de l'eau ultrapure, pour un facteur de dilution total de 1 000. Selon la concentration énoncée par le fabricant, 5 uL de la solution finale contiennent entre 700 et 1 200 billes (950 ± 250 billes), soit en moyenne une bille par volume de 5 nL. Ces dilutions permettent d'espérer qu'il n'y ait qu'une seule particule présente au même moment dans le volume de détection. A titre comparatif, le volume total de la cartouche en borosilicate est de 50 nL, soit 10 billes réparties sur 50 mm de canaux. En théorie, chaque bille est donc séparée de 5 mm de sa voisine la plus proche. Puisque l'empreinte laser ne mesure que quelques microns de diamètre, il est juste de considérer qu'une seule bille sera présente dans le volume sondé.
Les billes M-208, qui possèdent un diamètre de 2,8 um, ont tendance à sédimenter en quelques minutes seulement. Or, dans la gamme de débits utilisés (~0,50 uL/min), le volume mort du
système (~10 uL) impose un temps mort trop long pour que les billes demeurent dispersées en solution. Ces particules ont donc été étudiées sans la conjugaison au système de pompes et ont permis de développer le programme de traitement des données (section 3.2.2). Quant aux billes MyOne, dont le diamètre est de 1,0 um, aucune sédimentation significative n'a été observée. Ces particules ont donc servi lors des essais dans le système intégré.
3.3.2 Synthèse de nanoparticules cœur-coquille
Au sein de notre groupe de recherche, plusieurs étudiants travaillent à optimiser des structures de nanoparticules qui tirent profit de l'augmentation de la fluorescence par l'effet plasmon. L'utilisation de ce phénomène est bien documentée et est prometteuse pour plusieurs applications en biotechnologie [67-71]. En approchant un fluorophore près d'une nanoparticule métallique, l'oscillation de son dipôle peut entrer en résonance avec l'oscillation des électrons du métal. Il en résulte une augmentation de l'intensité de la fluorescence. En effet, non seulement plus de photons empruntent la voie de désactivation radiative, mais ils sont aussi promus plus facilement vers l'état excité. De plus, la proximité du métal fait chuter le temps de vie de fluorescence. Le processus de fluorescence peut donc s'effectuer plus rapidement et générer davantage de photons. Les fluorophores sont ainsi moins susceptibles de subir des réactions de désintégration se produisant à partir l'état excité. La photostabilité est par conséquent grandement améliorée. D'ailleurs, l'incorporation des fluorophores dans une matrice solide près du métal les protègent de l'extinction de fluorescence que peut induire l'environnement. Tout les métaux ne démontrent pas la même permittivité, ou mobilité de leurs électrons, et n'entrent pas tous en résonance dans le domaine de fréquence où oscillent la plupart des molécules organiques [72, 73]. Les métaux couramment étudiés sont l'or et l'argent. La forme, l'épaisseur ou la longueur que prendra la nanoparticule de métal influencera aussi la fréquence du plasmon [74]. Certains auteurs ont démontré l'application en bioreconnaissance à l'aide de surfaces d'îlots d'argent [75] alors que notre groupe de recherche étudie plutôt les nanoparticules de type cœur-coquille [76], dont le cœur ou la coquille est métallique.
Un étudiant au doctorat, Monsieur Danny Brouard, a réalisé une architecture de nanoparticule comprenant un cœur en silice dans lequel est incorporée de façon covalente de la fluorescéine [77]. Ce cœur a par la suite été recouvert d'une mince couche d'or [78]. Le schéma de synthèse
est présenté à la Figure 3.8. Pour réaliser le cœur, du 3-(aminopropyl)triéthoxysilane (APS) a été utilisé comme précurseur de silice. L'aminé, en excès, a pu réagir avec de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) pour former la thiourée correspondante. En ajoutant de l'ammoniaque 25 % et du tétra-éthoxysilane (TEOS), la thiourée a condensé en incorporant dans sa structure l'APS résiduel et du TEOS. Les nanoparticules formées ont été lavées et caractérisées au microscope électronique à transmission (TEM). Le diamètre moyen des cœurs de silice dopée est de 320 ± 40um. La surface des cœurs a par la suite été fonctionnalisée avec une monocouche de 3-(ammopropyl)triméthoxysilane (APTMS). En parallèle, une suspension de colloïdes de 2-3 nm de diamètre a été préparée en réduisant l'ion tétrachloroaurate (AuCl4~) en
milieu basique avec du chlorure de tétrakis(hydroxyrnéthyl)phosphonium (THPC). La fonction amine en surface des cœurs de silice possède une forte attraction pour les colloïdes d'or et ceux-ci s'y greffent spontanément. Une solution d'un sel d'or réductible a par la suite été ajoutée au mélange réactionnel. Les colloïdes à la surface des cœurs agissent alors comme sites de nucléation provoquant la croissance d'une couche d'or enrobant complètement la silice. Encore une fois, les nanoparticules ont été lavées et caractérisées au TEM. Par différence, on peut déduire que la couche d'or à la surface a une épaisseur moyenne de 30-40 nm.
a) onf.-
)
APS Baq. Diamètre: 320 ± 40 nm 1 um b) Nanoparticule de silice Srte» de nudèaaon Diamètre: 400 ± 50 nm Coqule d'orFigure 3.8 : Synthèse des nanoparticules cœur-coquille fluorescentes; a) formation du cœur en silice dopée; b) création de la coquille d'or
La concentration de nanoparticules est difficile à évaluer car les nombreuses étapes de lavage augmentent les pertes. Cependant, selon Imhof et colL, la synthèse préparée ci-haut contient 6,6 mg de silice par millilitre \JT\. La solution finale a été diluée d'un facteur 1 000 pour l'analyse. Le spectre d'excitation/émission des nanoparticules est disponible en annexe (9).