Chapitre 4: Résultats et discussion
4.1 Optimisation des paramètres expérimentau
Avant d'entreprendre l'analyse de nanoparticules, il faut fixer les paramètres expérimentaux de sorte que les performances globales du système soient optimales. Pour s'assurer des conditions idéales d'analyse, plusieurs aspects ont été caractérisés. Un choix de configuration microfluidique a du être fait parmi les cartouches et les connexions proposées. Les limites pratiques du système choisi ont du être établies afin de travailler dans une gamme de débits supportée par la cartouche microfluidique. L'optimisation du montage optique a aussi été effectuée. L'ajustement de la prédivergence a permis de déterminer la taille de l'empreinte laser au plan de détection de l'objectif de microscope. Par ailleurs, l'effet de la puissance d'excitation a été étudié afin d'optimiser le rapport du signal de fluorescence par rapport au signal de fond et au bruit correspondant. Cette section aborde tous les aspects pratiques de l'optimisation du système entier.
4.1.1 Choix de la configuration microfluidique optimale
La première configuration microfluidique étudiée est la cartouche en TPE fournie par 1TMI. La largeur du focus hydrodynamique a été établie en fonction des débits de la gaine et de l'analyte au centre. Pour ce faire, la cartouche à 60° a été connectée aux pompes. Une analyse en continu a été réalisée en emplissant la seringue de la pompe analyte avec une solution de LY concentrée à 10 uM. Le débit analyte a été maintenu constant et le débit de la gaine a été graduellement augmenté. Il est important de clarifier à ce point-ci que tous les débits de gaine qui seront énoncés dans les pages suivantes représentent le débit qui s'écoule d'un seul côté de l'analyte. Par exemple, pour incrémenter la gaine de 0,10 uL/min, la pompe sur laquelle repose la seringue doit être incrémentée de 0,20 uL/min. La gaine est composée d'eau ultrapure. Le focus hydrodynamique a été observé à l'aide d'un microscope de fluorescence (Olympus, BX51) mum d'une lampe au Xe ayant une puissance de 300 W et de filtres spectraux appropriés. Des photographies numériques ont pu être capturées à l'aide d'une caméra (Lumenera, Infinity2-1) et sont présentées en annexe (10). U est important d'accorder une période de temps suffisamment longue (~4-5 min) entre l'incrément du débit de la gaine et la prise de données afin de permettre aux pressions à l'intérieur de la cartouche de s'équilibrer et
d'obtenir un écoulement stable. La Figure 4.1 a) présente des photographies où l'on voit clairement le focus s'accentuer sous l'accroissement du débit de la gaine, pour un débit analyte constant. Plusieurs variations du débit de la gaine ont permis d'enregistrer différentes largeurs de focus hydrodynamique. À l'aide d'une application Labview, il est possible de déterminer l'intensité de la fluorescence dans une tranche du canal de sortie. En b), les profils d'intensité lumineuse sur toute la largeur du canal sont compilés, et ce, pour différents débits de la gaine. Les trois photographies présentées en a) sont reliées aux courbes 1,2 et 3 sur le graphique b).
a)
b)
1
Game: 0,10LJL.2
1
*j
1
Game: 0,10LJL. G«ne 0,50 uL/m n ( •ame 1,50 pL/min
11000-, 10000- ro ■ 3 o c
8
9000- 8000- o LC3 7000- 6000- ro c 5000- 4000- 3000- 2000-Analyte: LY. 10 uM. 0.50 uUmin Gaine: Eau nano. débit variable
-r -r 25 50 75 Largeur (pm) 100 Débit de la gaine 0,10uL/min 0,20 uL/min 0,30 uL/min 0,40 uL min 0.50 uL/min 0,60 uL/min 0,70 uL/min 0,80 uU mm 0,90 uLmin 1,00 uL/min 1,10uL/min 1,20 uL/min 1,30 uUmin 1,40 uUmin 1,50 uUmin Eau nano 125
Figure 4.1 : Étude de la largeur du focus hydrodynamique en fonction du débit de la gaine (cartouche en TPE, 60°, débit analyte fixe : 0,50 (xL/min, analyte : LY 10 |jM); a) image de microscopie de fluorescence; b) profil d'intensité de fluorescence dans la tranche du canal
La distribution d'intensité de fluorescence s'amincit avec l'augmentation de la gaine. Lorsque la gaine est très faible, on observe un plateau d'intensité de fluorescence indiquant que la concentration d'analyte est constante. À mesure que le débit de la gaine s'accroît, les zones de diffusion de part et d'autre de l'analyte se rapprochent, jusqu'à se chevaucher. L'intensité maximale de fluorescence au centre du flot analyte se trouve alors à diminuer. Il faut également noter que la vitesse linéaire du liquide augmente aussi avec la gaine. Il est possible d'évaluer la largeur du focus hydrodynamique à partir de la largeur à mi-hauteur (FWHM) des courbes de la Figure 4.1. L'expérience a été répétée pour d'autres valeurs de débit analyte afin de décrire le comportement de la cartouche en TPE 60°. Les résultats de cette étude sont compilés dans la Figure 4.2, où la relation non-linéaire entre la largeur du focus hydrodynamique et le débit de la gaine est évidente.
1 0 0 - 8 0 - d j % CC C ro 6 0 - 53 40 S5 co 2 0 - Débit analyte — ■ - 0,25 uL/min - • - 0,50 uL/min —A— 0,75 uL/min —T— 1,00 uUmin —♦ - 1,25 uL/min - ^ - 1 , 5 0 u L / m i n —r— 0,0 —r— 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,8 i
Débit gaine (uL/min)
- T — 1,2
" H — 1,4 1.6
Figure 4.2 : Étude de la largeur du focus hydrodynamique en fonction du débit de la gaine pour différents débits analyte
Si l'augmentation du débit de la gaine fait certes diminuer la largeur du flot analyte, il est intéressant de constater que lorsque le débit analyte est abaissé, la largeur du flot central décroît également. Par exemple, pour une gaine équivalente, un débit analyte de 1,50 |xL/min produira
un focus plus large qu'un débit de 0,25 uL/min. Cependant, la relation n'est pas proportionnelle et le focus ne sera pas automatiquement six fois plus large. Par ailleurs, on remarque que pour obtenir une largeur de focus préétablie, plusieurs combinaisons de débits gaine-analyte peuvent être choisies. En considérant la largeur du focus en fonction du ratio des pressions (gaine/analyte) plutôt qu'en fonction du débit de l'une où l'autre des composantes, on remarque que la largeur du focus est constante pour un même ratio, et ce, peu importe les débits. Ces derniers influenceront toutefois la vitesse linéaire du liquide.
Pour comparer le comportement des configurations microfluidiques de TPE et de borosilicate, le même type d'expérience a été reproduit avec les deux connexions disponibles pour la cartouche de borosilicate, soit avec les tubes de Tefzel et ceux en silice fondue. Il est à noter que la cartouche en TPE avec un angle de jonction de 30° présentait des déformations majeures sur la paroi de certains canaux. Celles-ci sont probablement survenues lors du démoulage. Cette géométrie n'a donc pas fait l'objet d'une analyse approfondie. La comparaison entre les différentes configurations peut être observée à la Figure 4.3. Les résultats sont présentés selon les ratios des débits employés, sur une échelle logarithniique. À titre comparatif, les photographies numériques des focus dans le borosilicate sont présentées en annexe (11). On y retrouve de plus un tableau récapitulatif des débits employés pour obtenir un ratio prédéterminé.
100-, CD
c
CD CD 2» CD—A- TPE, cartouche 60° - Plaques
- ■ - Micronit 90° - Tefzel
—•-- Micronit 90° - Silice fondue
1 ' i
0,1
i i i i i i
Ratio (D /D , )
' game analyte'
Figure 4.3 : Largeur du focus hydrodynamique en fonction du ratio des débits gaine et analyte pour différentes configurations microfluidiques
Le profil de rétrécissement du focus dans les trois configurations tend à ressembler à celui décrit à la Figure 2.4. Cependant, la cartouche en TPE forme le focus le moins accentué. Ceci est attribuable à la largeur du canal de sortie. En effet, contrairement à la cartouche en borosilicate, le canal de sortie dans le TPE est plus large que les canaux d'entrée. De ce fait, la proportion de la superficie de la sortie par rapport à la somme des canaux d'entrée est moins de 0,33. Dans le cas de la cartouche de borosilicate, l'étranglement est plus fort car, contrairement au TPE, la sortie possède une superficie équivalente aux autres canaux.
La cartouche en TPE et celle en verre munie de tubes de Tefzel ont démontré une pauvre tolérance à la pression, résultant en de nombreuses fuites. Le plancher des canaux de la cartouche de TPE ne sont scellés que par l'adsorption du TPE au verre de la lamelle de microscope. Une trop forte pression interne provoque la séparation des matériaux et on perd tout contrôle de la trajectoire du liquide. De plus, comme mentionné à la section 3.1.3, l'entrée commune pour les deux côtés de la gaine limite la pression applicable sur cette configuration.
Par ailleurs, le TPE n'est pas un polymère rigide. Celui-ci peut se contracter sous une forte pression. Il se crée donc une variation de pression à l'intérieur du canal qui est indépendante du contrôle de la pompe. Les parois du canal peuvent même aller jusqu'à se déformer de façon permanente. Le TPE ne démontre donc pas suffisamment de qualités pour être retenu comme substrat microfluidique. En outre, la cartouche de borosilicate est beaucoup plus résistante à la pression puisque les canaux sont complètement étanches. Néanmoins, la connexion adaptée aux tubes de Tefzel n'a pas su répondre aux attentes. Puisqu'elle n'est que déposée à l'entrée de la cartouche et que le polymère qui compose la férule est plutôt rigide, les fuites sont courantes. Or, une fuite dans une des trois entrées de liquide est suffisante pour déstabiliser considérablement le focus.
Le focus le plus étroit, le plus stable et le plus répétable a été obtenu avec la cartouche en borosilicate connectée à l'aide des férules pour tubes en silice fondue. D'ailleurs, cette connectique s'est avérée être de loin la plus étanche. Ainsi, la pression tolérée par cet assemblage est beaucoup plus élevée, permettant d'augmenter considérablement les débits. Il a été possible d'atteindre une largeur de focus de 3 ± 1 |am. C'est donc cette configuration qui a été retenue pour la poursuite du projet.
4.1.2 Établissement de la plage de ratios utilisables pour le focus hydrodynamique Afin de bien documenter le comportement de la configuration microfluidique choisie, la plage des débits où il est acceptable de travailler a dû être établie. Pour ce faire, deux expériences ont été menées dont les résultats sont présentés à la Figure 4.4. La première expérience consistait à établir le ratio minimal, u-min, qui peut être maintenu entre le débit de la gaine et celui de l'analyte. Le débit de la gaine est donc demeuré constant, à 0,25 |aL/min, alors que le débit du flot central a graduellement été augmenté. La deuxième expérience, quant à elle, tentait de déterminer le ratio maximal, Q-max, que peut soutenir la géométrie fluidique. Dans ce cas, le débit analyte a été fixé à 1,00 uL/min et le débit de la gaine a été accru.
a)
b)
Figure 4.4 : Établissement de la plage de ratios utilisable pour le focus hydrodynamique dans la cartouche en borosilicate; a) ratio minimal (débit gaine 0,25 uT/min); b) ratio maximal (débit
analyte 1,00 uL/min)
Sur la Figure 4.4 a), on remarque que l'analyte pousse si fort sur la gaine, qu'une partie du flot s'engage à la jonction de la gaine dans les canaux orthogonaux. Avec l'accroissement de l'analyte, une portion de la gaine cède en premier. Une faiblesse, possiblement attribuable à une bulle d'air dans le trou d'accès correspondant, pourrait expliquer ce manque de symétrie. La deuxième partie de la gaine recule aussi quelques instants plus tard. Le ratio minimal toléré par la cartouche en borosilicate est donc de 0,04. Sur la Figure 4.4 b), on note que l'augmentation du débit de la gaine amincit considérablement le flot analyte. De plus, comme dans le cas précédent, le liquide appliquant la plus forte pression commence à s'engager dans le canal opposé. L'analyte finit par battre en retraite et il est important de souligner que la pointe de liquide, formée par le focus, reste entière malgré un changement de direction dans la direction de l'écoulement Comme il en a été question à la section 2.1.2 avec la description de la Loi de Stokes, une des particularités de la microfluidique est la capacité du liquide à revenir à son point d'origine lorsque la force appliquée est renversée, et ce, sans aucune turbulence. On peut donc constater cet effet sur la quatrième photographie en b). Le ratio maximal établi pour cette cartouche est de 3,5. À partir des ratios minimal et maximal, il est possible d'isoler les paramètres géométriques propres au système. Les valeurs de y et rj peuvent être établies à l'aide des équations 2.7 et 2.8 et /? peut être défini à l'aide de l'équation 2.9 et d'une loi des moindres carrés. Cependant, cette analyse débordait du cadre de ce projet.
4.1.3 Ajustement de la prédivergence du système optique
Comme il a été décrit à la section 2.4.2, en variant la distance qui sépare les lentilles qui créent la prédivergence du faisceau d'excitation, il est possible d'ajuster la largeur d'excitation dans le plan de travail de l'objectif de microscope. La paire de lentilles (3) et (4) de la Figure 3.6 forme un faisceau collimaté, dont la divergence est inférieure à celle tolérée par le fabricant du collimateur (< 0,5 mrad), lorsque les montures sont séparées par 32 mm. Le plan de travail de l'objectif est défini à partir de l'emplacement du point focal de ce faisceau. En approchant les lentilles l'une de l'autre, on provoque une légère divergence. Le faisceau est alors guidé vers l'objectif de microscope et sa taille a été déterminée tout au long de l'axe optique pour caractériser le déplacement du point focal. Le diamètre est obtenu par la technique de diffraction laser sur lame de rasoir qui permet d'extraire le profil gaussien d'énergie [79]. Par convention, le diamètre du faisceau est établi lorsque l'énergie correspond à ~13 % du maximum, soit à 1/e2. La Figure 4.5 présente le déplacement du point focal le long de l'axe
optique, soit l'axe X dans le graphique suivant, pour différents écarts entre les lentilles de prédivergence. -3c5 -CD 3 CD
8
V)'a
zz ■o ■ * - > -CDE
CDb
4 5 0 - 4 0 0 - 3 5 0 - 3 0 0 - 2 5 0 - 2 0 0 - 1 5 0 - 1 0 0 - 5 0 - 0 - - 5 0 -Distance entre les lentilles prédivergentes ■ 32 mm, position collimée • 31 mm - A - 30 mm —T - 28 mm —♦-26 mm — i — ' — i — i — i — ' — i — ' — i — ' — i — ' — i — « — i — > — i — ' — i — ' — i 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6