i —
33
Figure 4.6 : Diamètre de l'empreinte laser au plan de travail selon la prédivergence
Le diamètre optimal de l'empreinte laser pour concorder avec la largeur d'un focus hydrodynamique de 3 ± 1 um a été fixé à 17 ± 1 um. De cette façon, on s'assure d'un recouvrement adéquat de la zone d'excitation avec le flot de particules dans la cartouche microfluidique. On limite aussi l'élargissement de la distribution d'intensité de fluorescence tel que décrit à la section 2.4.2. La distribution d'énergie au plan de travail possède une largeur à mi-hauteur de 11 um (FWHM).
4.1.4 Optimisation de la puissance d'excitation
entre le désir de stimuler l'excitation des analytes et celui de réduire au minimum les photons parasites émanant de la source (diffusion de Rayleigh et de Raman). Pour ce faire, des injections successives d'une solution de fluorophore (Lucifer Yellow, 2,5 uM) ont été réalisées dans la cartouche microfluidique en borosilicate, en augmentant graduellement la puissance d'excitation. Cette puissance a été évaluée à la sortie du collimateur à l'aide d'un wattmètre lorsque le diamètre du faisceau était de 1 mm. Le signal provenant du canal microfluidique a par la suite été enregistré à un taux d'acquisition de 1 kHz.
Le signal découlant d'une injection imite en quelque sorte le signal que l'on obtient en chromatographic liquide haute performance. En effet, au début de l'acquisition des données, il n'y a que de l'eau qui circule dans le canal et le signal généré est plutôt faible. Une fois le temps mort écoulé, le nombre de photons reçus au détecteur augmente, indiquant que l'analyte, le fluorophore, a rejoint le volume de détection. Après une certaine période variant selon le débit, le signal commence à diminuer, reflétant la diminution de la concentration d'analyte dans le volume sondé, pour rejoindre ultimement la ligne de base.
L'enregistrement de ces données permet de calculer, pour chaque puissance d'excitation, le rapport du signal de fluorescence, au maximum d'intensité, par rapport au signal de fond moyen de l'eau, pendant le temps mort. On peut aussi dresser le portrait de l'évolution du signal de fluorescence par rapport au bruit du signal de fond, soit l'amplitude des fluctuations du signal de l'eau du volume mort. La Figure 4.7 présente en noir les variations du signal de fluorescence par rapport au signal de fond et en bleu par rapport au bruit du signal de fond en fonction de la puissance d'excitation.
1 6 0 - 1 4 0 -
£
120 CD -o CD 100 .2) CO CD 80 c .g> CO tr 60 o Q . Q . CDor
40 2 0 --D— Signal/Signal de fond
-•— Signal/Bruit
,-30 - 2 5 J) œ 20 -o ■o o 3 - CO15 g
B5 E 1-10 2 10Puissance d'excitation (mW)
Figure 4.7 : Optimisation de la puissance d'excitation du système de détection
À la lumière de ces résultats, on observe qu'on a avantage à augmenter la puissance de la source. En effet, l'intensité de la fluorescence par rapport au signal de fond s'accroit considérablement en élevant la puissance de la source. C'est donc dire que la condition de saturation optique n'est pas atteinte à basse énergie et que la diffusion Raman ne domine pas la situation. Aussi, le rapport entre le signal de fluorescence et le bruit semble plutôt stable en fonction de la puissance. Autrement dit, en augmentant l'intensité de la source, on accroît autant le signal de fluorescence que le bruit sur le signal de fond. Ceci est un indicateur que l'origine principale des fluctuations du signal de fond provient des variations d'intensité de la source et que la diffusion de Rayleigh atteint le détecteur. En se plaçant dans un haut régime de puissance d'excitation, on améliore le contraste de la fluorescence par rapport au signal de fond, mais on contamine tout de même le signal avec les photons de la source malgré un filtre qui bloque 99,999 % de l'excitation (densité optique de plus de 6). Il a donc été choisi d'opérer à haut régime (~10 mW).
4.2 Validation de la méthode
Afin de valider la méthode, les particules magnétiques de 1,0 um fonctionnalisées avec du Lucifer Yellow ont été utilisées. Des solutions diluées ont été préparées quotidiennement, tel que décrit à la section 3.3.1, dont la concentration est de 950 ± 250 billes dans 5 uL. Pour évaluer la fiabilité de la technique, le seuil de détection, le taux de récupération ainsi que la répétabilité ont été établis. La pertinence d'utiliser le focus hydrodynamique pour augmenter la probabilité de détection a aussi été confirmée en étudiant le taux de recouvrement en fonction de la largeur du focus hydrodynamique.
4.2.1 Caractérisation : seuil de détection, récupération et répétabilité
La compilation des événements de fluorescence s'effectue à l'aide de l'algorithme Mathlab dont il a été question à la section 3.2.2. Ce programme nécessite l'emploi d'un seuil de détection qui est fixé par l'utilisateur. Au-delà de ce seuil les points adjacents sont regroupés et considérés comme un seul pic, ou événement Le point maximal de chaque pic est par la suite inclus dans une liste qui permet de réaliser une distribution d'intensité de fluorescence. Le seuil de détection doit être fixé avec précaution. Comme il a été abordé à la section 2.3, un seuil de détection élevé climinue le risque de comptabiliser de faux positifs, mais réduit du même coup la sensibilité de la technique. En revanche, un seuil trop faible prendra certes tous les événements en considération, mais augmentera substantiellement le nombre de faux positifs.
Le choix du seuil de détection a finalement été fixé à quatre fois l'écart-type sur le signal de fond (4 Cb). La Figure 4.8 présente bien la problématique rencontrée. En a), le signal de fond obtenu lors de la circulation de l'eau ultrapure dans le temps mort d'une injection de billes dans la cartouche en borosilicate est illustré. Lorsque le seuil de détection est fixé à 3 ab, le
programme détecte 27 événements de fluorescence en 10 s seulement. Normalement, en plaçant le seuil à 3 ab, moins de 1 % des valeurs seront supérieures à cette limite. Or, en
enregistrant le signal à une vitesse de 2 kHz, le nombre de faux positifs est considérable. Par ailleurs, l'acquisition de données s'échelonne sur une longue période de temps car il peut s'écouler plusieurs minutes avant l'écoulement complet de la boucle d'injection contenant l'analyte. En fixant le seuil de détection à 4 ob, aucun faux positif n'est enregistré. En b) sur la
MyOne dans le volume sondé. Le seuil tracé en vert montre que plusieurs des événements ont une intensité passablement supérieure au seuil. Par ailleurs, la concentration théorique dans la solution est de 950 ± 250 billes dans 5 uL (700-1200 billes/5 uL, selon le fabricant). En ajustant le seuil à 4 ab, on compte dans cet essai 673 billes alors qu'en choisissant le seuil à 3 ob,
on en compte plus de 7 000. Or, ceci est tout à fait improbable et confirme le choix du seuil de détection. a) 120 T
f 10°
8 c 80 § «° ë ■S 40 Cffi Signal de fond - 3 SIG - 27 IMes" - 4 SIG > aucun faux pos*fl » ^ T * f l ",Wri n,' W T * «T'^JW»" c 2 0 - 4 6 Temps (s) 10 100 150 Temps (s) 250
Figure 4.8 : Signaux typiques obtenus lors d'analyses en focus hydrodynamique dans la cartouche en borosilicate (acquisition 2 kHz, vitesse linéaire ~33 mm/s); a) signal de fond, eau
ultrapure; b) billes LY 1,0 um
Lors de cette analyse, le ratio de focus hydrodynamique a été fixé à 2 pour obtenir une largeur de 9 um pour des raisons de stabilité temporelle. La gaine avait un débit de 0,80 uL/min et l'analyte avait un débit de 0,40 uL/min. L'apport total en liquide dans le canal de sortie est donc de 2,00 uL/min pour résulter en une vitesse linéaire calculée de ~33 m m / s . Pour traverser l'empreinte laser, les billes mettent donc un peu plus de 0,5 ms. L'acquisition des données à 2 kHz permet de recueillir en théorie au moins une donnée par événement. Par contre, ceci implique que certaines intensités auront été enregistrées au moment où la bille entre, ou sort, du volume de détection sans en être en plein centre, où le signal est potentiellement maximal. Ceci induira une plus grande variabilité dans les signaux recueillis. D'ailleurs, bien qu'on ne puisse le voir sur la Figure 4.8 b), la majorité des pics ne présentent qu'un seul point. Il est donc difficile d'attribuer chaque pic au passage d'une seule bille dans le
volume de détection. Cependant, la faible concentration de billes permet de considérer, au niveau statistique, qu'une seule bille est présente dans la zone d'intérêt. De plus, la concentration expérimentale est très près la valeur théorique, en considérant l'erreur énoncée par le manufacturier. Il est à noter qu'avec une acquisition plus rapide, l'écart-type est sous- estimé car une partie du signal de fond tombe sous zéro, dans le bruit numérique du système électronique. Aussi, la limite inférieure de débit est appliquée. Les particules ne peuvent donc pas aller plus lentement À des débits inférieurs, le focus est instable et le risque de sédimentation augmente largement.
Avec les données extraites de l'algorithme Mathlab, il est possible d'ordonner les valeurs dans un histogramme où les événements d'intensités similaires sont regroupés. Pour fin de comparaison, un blanc d'analyse a été effectué avec des billes MyOne dont la surface n'est pas fonctionnalisée. La même dilution a évidemment été réalisée pour le blanc. La Figure 4.9 présente les distributions d'intensité de fluorescence obtenues pour chaque type de bille.
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E
o 100 Billes LY 1,0 pmConcentration théorique: 950 billes/5uL (±250) Débit gaine: 0,8 uL/min
Débit analyte: 0,4 uL/min Largeur analyte: 9 pm Vitesse linéaire: ~33 mm/s
Billes nues: 96 billes
Billes LY: 673 ± 100 billes (4 replicas)