Facilement applicables, les prélèvements sur papier buvard permettent de recueillir du sang prélevé sur tube EDTA ou par piqûre au talon ou au doigt, tant en ville que dans des régions décentralisées. Ils permettent de conserver les échantillons de sang séché à température ambiante (ou congelés), dans des sacs étanches en prévenant l’humidité. L’ARN viral contenu sur le buvard imbibé de sang total ou de plasma peut se conserver à température ambiante ou à –70°C et est stable durant au moins un an (Fiscus et al., 1998).
Le DBS a également l’avantage de s’acheminer facilement vers les laboratoires, ce qui favorise dès lors la décentralisation. Par ailleurs, la technique du recueil de sang sur papier buvard évite le déplacement d’équipes spécialisées puisque le prélèvement peut être réalisé par toute personne correctement formée.
Les données indiquent que la détermination de la charge virale et l’évaluation de la résistance génotypique du VIH-1 par le DBS et le DPS sont possibles ; plusieurs études ont obtenu des résultats comparables même après stockage à long terme (Hamers et al., 2009).
C’est pour cette raison que nous avons décidé d’étudier cette sensibilité du DBS sur des échantillons des patients tchadiens infectés par des sous-types non-B. Dans ce chapitre, nous décrivons la méthodologie utilisée pour la collecte du sang sur DBS, sa conservation, l’extraction du matériel génétique ainsi que la technique utilisée pour le séquençage. Dans la partie résultats originaux, nous allons présenter les résultats obtenus (sous-types et mutations de résistance) sur DBS par la technique de l’ANRS que nous comparerons avec les résultats obtenus sur le plasma.
5.2. Méthodologie
Le sang est prélevé sur EDTA au pli du coude et 75 µl sont déposés sur papier buvard de type Whatman® 903. Il est noté les informations suivantes : les initiales du patient, sa date de naissance, la date du prélèvement et le numéro d’identification de la fiche. Cinq spots (375 µl de sang au total) sont utilisés pour chaque patient. Le séchage est fait pendant une nuit à température ambiante et à l’abri de la lumière conformément à plusieurs études. Le lendemain, ces buvards sont mis dans un emballage en plastique contenant deux dessiccants.
La conservation est faite à -20 °C jusqu’au transport en Belgique pour les analyses.
Chapitre V : Utilisation du DBS (Dried Blood Spot) pour le monitoring biologique
L’extraction de l’ARN viral est effectuée avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit. Nous avons fait recours à la technique de l’ANRS pour réaliser le séquençage (ANRS AC11 Resistance Study Group, 2008) sur un total de 30 DBS.
5.3. Résultats originaux
Les mutations de résistances sont recherchées sur 30 échantillons de patients VIH-1 positif sur DBS et sur plasma. Un taux d’amplification de 80 % (24/30) est obtenu sur le DBS. La limite de détection du buvard est de 3,33 log10 ce qui équivaut à 2 150 copies/ml.
Cette différence par rapport au plasma pourrait s’expliquer par les techniques d’extraction utilisées et aussi par la limite de détection du DBS pour les charges virales faibles. Il faut noter cependant que certains sous-types sont moins sensibles sur papier buvard que sur plasma. Les virus archivés dans les lymphocytes peuvent être différents de ceux présents dans le plasma (CNS & ANRS, 2013). C’est pour cette raison que nous avons remarqué la présence du sous-type K sur DBS alors qu’il n’a pas été trouvé dans le plasma.
Tableau 9 Mutations de résistance détectées sur plasma vs DBS
ID CV
Chapitre V : Utilisation du DBS (Dried Blood Spot) pour le monitoring biologique
Pour les analyses des séquences, nous avons remarqué que pour un même patient, nous pouvions avoir un sous-type différent sur la Reverse Transcriptase et (un autre différent) sur la Protéase. Cette distribution est représentée dans le tableau ci-dessous :
Tableau 10 Comparison des sous-types détectés sur plasma vs DBS
DBS/Plasma Nombre Pourcentage (%)
CRF02_AG None K20I M184V V90I, K101E, V106I, G190A 108 4,39 CRF02_AG/
CRF02_AG None K20I None V90I
110 5,09 CRF02_AG/
CRF02_AG None K20I M41L, D67N,
M184V, T215F A98G, Y181C
Chapitre V : Utilisation du DBS (Dried Blood Spot) pour le monitoring biologique
Pour le résultat final, nous avons retenu les sous-types obtenus sur les séquences de la Protéase qui est la région la moins changeante du virus. Le CRF02_AG est le plus représenté tant sur DBS (29,17 %; 7/24) que sur le plasma (30,23 %; 13/43). Il existe des concordances entre le DBS et le plasma comme le montre le tableau ci-dessus. Le sous-type K est présent (3/24; 12,5 %) sur DBS alors qu’il est absent dans le plasma. Ceci serait l’une des conséquences de l’utilisation du BDS qui favorisera l’apparition des souches virales archivées dans les cellules comme nous l’avions dit ci haut.
Le sous-type K est décrit dans la littérature comme minoritaire et retrouvé en Afrique Centrale (Hemelaar et al., 2011). Selon Javaugue, il était initialement apparenté au sous-type F pour former un sous-type F3 (Javaugue, 2014).
5.4. Résumé des résultats du chapitre V
Mise à part l’utilisation du buvard pour le diagnostic précoce chez l’enfant comme le recommande l’OMS (GIP Esther., 2008) et pour la surveillance de la résistance au traitement (Bennett et al., 2008), le DBS est utilisé pour le dépistage des troubles métaboliques chez les nouveaux nés (McCabe etal., 1987), pour la détection des anticorps VIH-1 (Hoff et al., 1988) mais aussi pour le diagnostic infantile du VIH-1 par PCR ADN (Stevens et al., 2008). Le DBS peut cependant très bien servir pour l’évaluation du traitement antirétroviral pour les sous-types non-B.
Le kit QiAamp Viral RNA mini kit pourrait être utilisé pour l’extraction de l’ARN viral en vue de la détection des mutations de résistance par séquençage ou par ASPCR.
Sur DBS, un taux de réussite d’amplification de 80 % (24/30) par rapport au plasma est observé.
Pour un même patient, des variations des sous-types sont parfois observées au niveau de la Protéase et de la Reverse Transcriptase.
Le séquençage sur DBS a montré la présence du sous-type K (3/24 ; 12,5 %) au niveau de la Reverse Transcriptase alors qu’il est absent dans le plasma après séquençage.
Chapitre V : Utilisation du DBS (Dried Blood Spot) pour le monitoring biologique
La limite de détection du papier buvard pour le test de résistance par la méthode de l’ANRS est de 3,33 log10 ce qui équivaut à 2150 copies/ml.