Résumé des résultats du chapitre VI - Prévalence des mutations de résistance acquises et divers

CHAPITRE VI. Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique

6.4. Résumé des résultats du chapitre VI

 A l’issue des résultats observés dans notre étude, le taux d’échec aux médicaments de première ligne à N’Djamena au Tchad est de 43,10 % (n = 116). Aucune association significative entre le taux d’échec et le sexe n’a été observée (p  0,05). Il est important de noter que l’échec thérapeutique n’est pas seulement dû à une apparition d’une mutation de

Chapitre VI : Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique

résistance au niveau du virus, mais peut s’expliquer aussi par une faible observance ou une interruption prolongée du traitement (OMS, 2012).

 Le taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) est de 56,897 % (66/116) ; la prévalence de la résistance parmi les individus ayant une CV ≥ 1000 copies/ml est de 74%

(37/50).

 La prévalence de la résistance acquise est de 31,9 % (37/116). Cette prévalence est inférieure à celle trouvée par Koyalta et al. (2009) dans la même population N’Djaménoise qui est de 64 % (n = 88).

 Il ressort de cette étude qu’un nouveau sous-type J circule à N’Djaména avec un taux de 30,23 % (13/43). Après analyse phylogénétique, il s’est avéré que ce nouveau sous-type J est apparenté au sous-type F. La littérature décrit que les sous-types F, H, J et K sont incriminés dans un nombre restreint d’infections dans le monde (0,94 %) avec prédominance du sous-type F1 (0,45 %) (Javaugue, 2014). Ceux-ci sont généralement rencontrés en Afrique Centrale (Burda et al., 2004; Triques et al., 1999, 2000).

 Une résistance élevée de plus de 50 % est observée pour les INNTI chez plus de la moitié des patients avec 74 % pour la NVP et 55,8 % pour l’EFZ. Pour les INTI, une forte résistance à la 3TC est observée chez 29 patients, soit 67,5 %. Ces résultats se révèlent être alarmants quant aux patients qui sont sous Viraday et Duovir N actuellement à N’Djaména.

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

Chapitre VII

Détection des mutations ponctuelles de

résistance (Allele-Specific PCR)

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR) CHAPITRE VII- Détection des mutations de résistance ponctuelles (ASPCR)

7.1. Introduction

Utilisée pour la première fois en 1991 pour la détection des mutations de résistance du VIH-1 (Larder et al., 1991), l’ASPCR est une technique qui permet de détecter une mutation de résistance à faible proportion (1 %) dans un échantillon. Les techniques génotypiques standard quant à elles ne détectent un variant (un nucléotide muté) que s’il est majoritaire et représente au moins 20 % de la population virale totale (Brun-Vezinet et al., 2004; Grant et al., 2003; Halvas et al., 2006; Palmer et al., 2005). Avec les récentes technologies de la PCR en temps réel, l’ASPCR a vu sa sensibilité augmenter (Metzner et al. 2003, 2005). Cette sensibilité de détection des mutations mineures à moins de 20 % a un intérêt clinque majeur dans les PRL et surtout quand il s’agit du développement de la résistance à la Névirapine dans la PTME (Eshleman et al., 2001; Jackson et al., 2000). Cependant, La nature exacte de l'importance clinique de mutations mineures reste incertaine, mais les données indiquent que la circulation des souches virales résistantes au traitement contribue à l'échec virologique (Jourdain et al., 2004; Lecossier et al., 2005) et peut permettre la prédiction d'échec virologique à un stade précoce.

La résistance à la classe des INNTI est conférée par une seule mutation au niveau du gène de la Reverse Transcriptase. Il s’agit de la K103N ou de la Y181C occasionnant ainsi une résistance croisée à la Névirapine ou à la l’Efavirenz du fait de leur faible barrière génétique.

La mutation M184V au niveau de la Reverse Transcriptase est impliquée dans la résistance élevée à la Lamivudine. Il a été démontré que les virus qui développent cette mutation sont incapables de subir une mutagenèse compensatoire suite à la suppression de la boucle située en amont du site de liaison de l’amorce (Wei et al., 2002, 2003).

Considérant les molécules utilisées pour le traitement au Tchad, compte tenu aussi de l’importance de chacune des mutations de résistance suscitées et conformément à celles rencontrées dans notre étude, celles qui sont choisies pour la technique ASPCR sont les suivantes: K103N (AAC); Y181C (TGT); M184V (GTG); T215Y/F (TAC ou TTC) et K70R (AGA). Nous décrivons dans ce chapitre les résultats de la technique ASPCR obtenus sur DBS et sur le Plasma. Dans la partie résultats originaux, la sensibilité de la technique ASPCR

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

par rapport aux différentes mutations obtenues par séquençage sur plasma et sur DBS sera aussi décrite.

7.2. Méthodologie

Au niveau du plasma, six mutations conférant des résistances majeures ont été sélectionnées pour l’ASPCR tandis que pour le DBS, nous n’avons étudié que deux de ces mutations. Il s’agit de la K103N et de la M184V. Pour le plasma, 44 échantillons ont été utilisés contre 24 pour le DBS ; ces échantillons sont ceux ayant donnés des résultats positifs au séquençage. La procédure de cette méthode est détaillée dans la partie méthodologie de ce document. Pour chaque mutation, deux PCR sont réalisées dans deux tubes différents. Une première PCR avec l’allèle normal (générique) et une seconde PCR avec l’allèle muté. Les amorces utilisées sont celles générées spécifiquement pour les sous-types A, C et D. Nous avons testé tous les sous-types et formes recombinantes retrouvés par séquençage pour en évaluer la sensibilité de la technique pour les autres sous-types présents chez nos patients qui sont F, G, J et CRF02_AG.

La PCR est réalisée sur LightCycler480 (Roche). La technique utilisée détermine la quantité absolue de la séquence d’acide nucléique à l’intérieur d’un échantillon inconnu. Des séries des dilutions des échantillons connues sont utilisées pour générer la courbe standard.

Des échantillons contrôles ont été employés pour chaque run. Pour chaque mutation, un échantillon connu contenant la mutation à rechercher est dilué cinq fois et testé avec le primer générique et le primer muté. Un autre échantillon connu, de sous-type non-B, servant de contrôle négatif, ne contenant pas de mutation (sauvage) est aussi dilué et inséré dans chaque run.

7.3. Résultats originaux

Evaluation de l’ASPCR

Nous avons utilisé un échantillon positif à la mutation recherchée (muté) à 10⁵ log copies/ml et un autre échantillon négatif à la mutation (sauvage) pour évaluer la technique.

Tous deux étaient de sous-types non-B des patients africains. Des dilutions ont été effectuées pour chacun des deux contrôles utilisés. Ils sont ensuite dilués (de 0,01 % à 100 %) et testés

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avec des primers spécifiques pour chaque mutation recherchée. Au total 5 dilutions ont été exécutées pour construire la courbe standard: 100 % ; 10 % ; 1 % ; 0,1 % et 0,01 %.

Pour évaluer la discrimination de la technique, nous avons utilisé la différence des threshold cycles (Ct) ou crossing points (Cp) obtenues entre le virus muté et le mélange (sauvage-muté). Pour chaque dilution, nous avons fait deux réactions avec l’allèle normal et deux avec l’allèle muté ; la valeur moyenne des Ct de chaque dilution est utilisée nous a permis de mesurer la sensibilité et la précision de la technique pour les différentes mutations.

Pour obtenir le mélange sauvage-muté, nous avons mis du virus sauvage dans les dilutions de l’échantillon muté. Le cycle seuil est déterminé par la valeur des Ct moyenne ± 2 (écart type).

NB: La présence du virus muté dans le mélange est avérée si la valeur du Ct est inférieure à celle du seuil retenu pour chaque type de mutation.

Figure 13 Courbes standard des différences des Ct (sauvage-muté) pour les différentes mutations

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Pour chacune des courbes, le coefficient de corrélation de Pearson indique une bonne corrélation avec R²> 0,97 pour le virus muté et R²> 0,96 pour le virus wild-type.

Figure 15 Exemple de la courbe d'amplification (générique et sauvage) avec différences des Ct pour la K103N

Une valeur Ct seuil est fixée (35 pour cette courbe) et toutes les courbes qui sortent après cette valeur sont considérées comme négatives. La différence de Ct entre la première

Ct

fig.14a : Corrélation Y181/Y181C fig.14b : Corrélation M184/M184V fig.14c : Corrélation K103/K103N

Fig.14d : Corrélation T215/T215F fig.14e : Corrélation T215/T215Y fig.14f : Corrélation K70/K70R

Figure 14 Courbes standard avec le primer générique et muté des différentes dilutions

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courbe (Ct = 7) et la deuxième (Ct =20) permet de définir une différence de Ct (Ct) qui est de 13.

Spécificité de l’ASPCR

Pour mesurer la spécificité de la technique pour chaque mutation, nous avons calculé les différences des Ct des différentes dilutions du mélange (sauvage-muté). Une valeur seuil est fixée et est utilisée pour la comparaison avec celle de l’échantillon sur lequel est recherchée la mutation. Les valeurs des différences des Ct (Ct) de toutes les mutations sont plus de 9 sauf pour la K70R qui est de 6 ; ce qui indique que toutes les amorces spécifiques peuvent distinguer avec précision le virus muté.

Les différences des Ct retenues pour la validation des résultats sont : Ct= 13 pour la K103N ; Ct = 9 pour la M184V ; Ct =12 pour la T215F ; Ct =12 pour la T215Y ; Ct =9 pour Y181C et Ct = 6 pour K70R. Tous les contrôles positifs sont en dessous du seuil de ces valeurs.

Sensibilité, précision et reproductibilité de la technique

Au total 5 dilutions variant de 0,01 % à 100 % ont été réalisées et amplifiées avec des amorces spécifiques. Les valeurs des Ct observées sont inférieures à la valeur seuil définie, ceci voudra dire que les mutations de résistance peuvent être détectées même avec une faible proportion de 1 %.

Chaque analyse est réalisée en double. La différence des Crossing point (ct) de chaque échantillon comparée au Ct (Cycle Threshold) ou Cp (Crossing point) des contrôles sauvage et muté est utilisée pour la validité des résultats. Si la mutation recherchée (A/C) est présente, le test est considéré comme positif. Le test peut seulement être positif pour une seule réaction. Dans ce cas, s’il n’est positif qu’avec le primer générique, on dit que le sujet est sauvage homozygote (A/A). S’il n’est positif qu’avec le primer muté, on dit que le sujet est homozygote muté (C/C). Le résultat est considéré comme faux positif si la valeur du Ct est supérieure à la valeur seuil retenue pour chaque mutation et que la différence des Ct apparaît en dehors du seuil de positivité défini.

Classiquement, la précision est estimée à partir de la reproductibilité intra-essais et de la reproductibilité inter-essais. Ces paramètres qui sont alors quantifiés par le coefficient de variation (CV %) ou écart-type relatif: CV = (Ecart-type/moyenne) x 100. Le coefficient de variation est le rapport de l'écart-type à la moyenne. Plus la valeur du coefficient de variation

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est élevée, plus la dispersion autour de la moyenne est grande. Il est généralement exprimé en pourcentage. Sans unité, il permet la comparaison de distributions de valeurs dont les échelles de mesure ne sont pas comparables. Lorsqu'on dispose de valeurs estimées, le CV rapporte l'écart-type de l'estimation à la valeur de cette estimation. Plus la valeur du coefficient de variation est faible, plus l'estimation est précise.

Pour évaluer la reproductibilité intra-essais et inter-essais de la technique, nous avons dosé trois fois dans la même série les dilutions du mélange de 1 % à 100 %. La moyenne et l’écart type observés nous ont permis de calculer pour chaque série le coefficient de variation.

Nous avons ensuite calculé les coefficients de variation à partir des différentes valeurs observées pour chaque type de mutation.

Tableau 18 Coefficients de variation intra et inter-essais

Coefficients de Variation intra-essais

Proportion du mutant (%) M184V Y181C K103N T215F T215Y K70R

100 0,13 0,12 0,08 0,05 0,13 0,02

10 0,29 0,15 0,23 0,24 0,34 0,21

1 0,39 0,36 0,42 0,43 0,41 0,28

Coefficients de Variation inter-essais

Proportion du mutant (%) M184V Y181C K103N T215F T215Y K70R

100 0,23 0,31 0,12 0,04 0,19 0,12

10 0,33 0,25 0,31 0,32 0,37 0,24

1 0,42 0,37 0,37 0,45 0,41 0,37

Les coefficients de variation intra-essais observées sont inférieurs à 0,13 pour la proportion 100 % du virus sauvage (wt) ; inférieurs à 0,35 pour 10 % wt et aux alentours de 0,41 pour la dernière proportion qu’est de 1 % wt. Pour les CV inter-essais, ils sont inférieurs à 0,32 pour le 100 % sauvage; d’environ 0,31 pour le 10 % wt et inferieurs à 0,46 pour la proportion 1 % du virus sauvage.

Toutes les valeurs en inter et intra-essais sont faibles et ne dépassant pas 0,46. Ceci signifie que l’estimation de la technique est beaucoup plus précise.

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

Tableau 19 Mutations de résistance détectées par ASPCR (Plasma)

CV Log10 Résultats ASPCR

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ID = Identification patient. wt = wild type = virus sauvage (pour réaction négative) ; + = réaction positive (pour la mutation recherchée). Un faux positif (N°15) est observé pour la K103N.

Les résultats obtenus par les deux méthodes (séquençage et ASPCR) nous ont permis de comparer les différentes mutations par rapport aux sous-types.

Tableau 20 Comparaison des mutations de résistance en fonction des sous-types détectés par ASPCR vs plasma

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR) Au total 44 échantillons positifs au séquençage sont soumis à la technique ASPCR comme nous l’avons mentionné plus haut. Pour les sous-types A et D pour lesquels les primers sont conçus spécialement, nous remarquons une sensibilité de 100 % de l’ASPCR par rapport au séquençage pour toutes les mutations sauf à la Y181C qui n’était pas présente pour le sous-type D même au séquençage. Une spécificité est observée pour le sous-type J et CRF02_AG pour la K103N, la Y181C, la M184V et la T215Y. Le sous-type F a lui aussi une spécificité de 100 % pour la M184V par l’ASPCR.

Figure 16 Quantifications des mutations de résistance détectées par ASPCR vs plasma

Détection des mutations ponctuelles sur DBS avec la technique du séquençage de l’ANRS et l’ASPCR

Cette technique de la détection des mutations ponctuelles (ASPCR) est très spécifique puisqu’elle détecte aussi d’autres sous-types tels que le sous-type J, F et CRF02_AG avec des primers conçus pour les sous-types A et D. Cela révèle l’existence d’un polymorphisme spécifique pour les sous-types testés positifs.

Tableau 21 Evaluation de la sensibilité de l'ASPCR par rapport au séquençage sur DBS vs plasma

Mutations Séquencage (plasma) ASPCR (DBS)

K103N 7 5

M184V 13 8

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR) Pour le DBS, nous n’avons testé que 24 échantillons pour deux mutations par ASPCR, il s’agit de la K103N et de la Y181C. Les primers sont générés spécifiquement pour les sous-types A, D et C. En l’absence du sous-type C dans notre étude, et du sous-type A sur DBS, la proportion des sous-types D, J et du CRF02_AG détectés par séquençage et par ASPCR sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau 22 Distribution des mutations de résistances détectées par ASPCR par rapport aux sous-types détectés sur DBS ponctuelles sur DBS est quasi égale à celle sur le plasma.

7.4. Résumé des résultats du chapitre VII

1. L’Allele-Specific PCR (ASPCR) peut être utilisée pour une évaluation qualitative des mutations de résistance et aussi quantitative pour la mesure de la charge virale.

2. Une spécificité de 100 % est obtenue avec l’ASPCR sur DBS pour les sous-types D, CRF02_AG et J pour toutes les deux mutations recherchées (K103N et M184V). Il pourrait bien s’agir d’un polymorphisme spécifique des sous-types non-B au niveau de la Reverse Transcriptase.

3. L’ASPCR est une méthode fiable de détection de mutations de résistance ponctuelles mineures à hauteur de 0,01 %.

4. Elle est la méthode de choix pour la détection des mutations de résistance mineures dans un échantillon; les coefficients de variation en intra et inter-essais sont tous inférieurs à 0,50; ce qui montre que l’estimation de la technique est plus précise.

5. L’ASPCR peut être utilisée pour détecter plusieurs mutations dans un même échantillon.

6. La technique ASPCR fournit aussi des informations sur l’évolution de la résistance.

Discussion générale

Discussion générale

Evaluation immunovirologique du traitement antirétroviral

Lors d’une infection par le VIH, les principales cellules cibles du VIH sont les lymphocytes TCD4 du système immunitaire, qui portent à leur surface des molécules CD4 indispensables à la pénétration cellulaire du virus. En utilisant les lymphocytes CD4 pour se répliquer, le VIH entraîne leur destruction entrainant la circulation importante du matériel viral dans la circulation sanguine et aussi l’épuisement du système immunitaire ; ce qui permet l'apparition des infections opportunistes. C’est pour cette raison que nous avons d’abord fait une évaluation immunovirologique chez tous les 116 patients et ensuite chez les patients qui étaient sous Triomune. Cette évaluation est faite dans l’objectif de mesurer l’efficacité du traitement et apprécier la réponse du système immunitaire.

Les lymphocytes TCD4 et la charge virale sont évalués avant le traitement (J0) et après huit mois de traitement (M8). L’étude a montré que le nombre des patients qui étaient à plus de 500 CD4/mm3 avant le traitement est passé de 30 à 19. La médiane au J0 est de 248 alors que celle de M8 est de 298,5 (test de Mann-Whitney, p = 0,75). La moyenne des CD4 avant le traitement et après 8 mois de traitement n’a pratiquement pas évoluée: 309 vs 344 (p

= 0,62). Ces résultats témoignent la faible reconstitution du système immunitaire chez nos patients. Normalement, la charge virale devient indétectable dans le plasma (inférieure à 50 copies/ml) une dizaine de semaines après le début du traitement tandis que les CD4 amorcent leurs remontée dans les quatre à huit semaines du traitement, mais cette première remontée est attribuée au passage des CD4 des ganglions lymphatiques au flux sanguin (Routy, 2009).

Le taux d’échec aux médicaments de première ligne trouvé dans notre étude est de 43,10 % (50/116). La mauvaise observance est notifiée à hauteur de 80 % des patients chez tous ceux ayant fait partie de notre étude. Une corrélation positive est observée entre la mauvaise observance et le taux d’échec immunovirologique (p < 0,05). La mauvaise observance peut avoir diverses raisons liées au patient, à son environnement et à la molécule utilisée ou aux acteurs de la santé. Certains patients sautent des prises, par oubli ou par négligence, ce qui peut favoriser l’émergence de résistance du VIH aux traitements. D’autres se fient aux marabouts et guérisseurs traditionnels qui leur font croire que la guérison du Sida est possible. Il faut noter que cette pratique n’est pas sans conséquences car elle contribue à la dégradation de l’état de santé des patients qui sont parfois sujets à des nombreuses infections

Discussion générale

opportunistes.

Parmi les 48 patients qui étaient sous Triomune, nous avons observé cependant que le taux d’échec à la Triomune est de 43,75 % (21/48) et plus de 81 % de ces patients étaient en mauvaise observance. Cette mauvaise observance comme l’ont notifiée les médecins pourra aussi favoriser l’émergence de résistance aux médicaments dont la barrière génétique est faible à l’exemple des INNTI. Une seule mutation telle que la K103N ou la Y181C pour ce groupe (NVP et EFZ) peut entrainer une résistance totale et irréversible.

En somme, les CD4 et la charge virale constituent les paramètres primordiaux pour l’évaluation immunovirologique quand ils sont réalisés régulièrement c’est à dire à 1 mois et 3 mois de traitement, puis tous les 3 mois la première année. Nous rappelons aussi que la fréquence pour le suivi immunovirologique à l’HRGN n’est pas standard. Les rendez-vous ne sont pas respectés ou les examens ne sont pas réalisés pour une raison ou une autre (manque des réactifs, panne des appareils, grève du personnel, etc.). Généralement, pour les patients ayant une charge virale indétectable au-delà d’un mois de traitement, un contrôle immunologique doit en principe être réalisé tous les 3 à 4 mois si les CD4 sont inférieurs à 500 cellules/mm³ et tous les 4 à 6 mois si les CD4 sont supérieurs à 500 cellules/mm³(Yeni, 2008). Fener déclare aussi qu’un taux de CD4 plus bas à l’initiation du traitement associé à une charge virale plasmatique supérieure à 100 000 copies/ml et un antécédent d’événement classant sida, sont associés à une moins bonne évolution clinique sous traitement (Fener, 2011). Routy affirme quant à lui que beaucoup des patients ont réussi l’augmentation de leurs CD4 jusqu’à 350 à 500 celles/mm³et que ceci reste un objectif thérapeutique additionnel ; ceci est la conséquence d’une meilleure reconstitution du système immunitaire si le traitement est entrepris avant la chute des CD4 à moins de 350 cellules/mm3 (Routy, 2009).

Comparaison des techniques de mesure de la charge virale

Evaluer les différentes techniques de mesure de la charge virale pour les sous-types non-B est l’un des objectifs spécifiques de cette étude. S’agissant de la mesure entre Cobas et Abbott RealTime, deux échantillons non détectés à l’aide d’Abbott sont détectés avec le test Cobas V2.0 avec respectivement 2,23 et 2,68 Log10. Cette variation pourrait être due à une erreur de manipulation ou à un blip comme décrit dans la littérature pour la version V 2.0 du

Dans le document NOUVELLES APPROCHES GENOTYPIQUES POUR LE MONITORING DE RESISTANCE DU VIH AUX ARV DANS LES PAYS A RESSOURCES LIMITEES : CAS DU TCHAD (Page 110-165)