Techniques d’amplification et de détection des mutations de résistance

Puisqu’il s’agit des patients sous première ligne, le séquençage ne concernera que deux enzymes du gène POL: la Reverse Transcriptase et la Protéase.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

La technique utilise des amorces et des sondes qui peuvent interagir avec des acides nucléiques, par exemple les acides nucléiques qui codent pour la Reverse Transcriptase ou la Protéase du VIH. Cette technique concerne également un oligonucléotide comprenant une quelconque séquence nucléotidique parmi la liste des différentes séquences identifiées.

Chacun desdits oligonucléotides est une sonde ou une amorce (ANRS AC11 Resistance Study Group, 2008).

Cette méthode se rapporte également à des mélanges d'amorces et de sondes, destinés à être employés dans des réactions RT-PCR et des réactions PCR primaires. Elle concerne en outre des procédés pour détecter de manière spécifique plusieurs mutations du VIH. Les mutations au sein de la Reverse Transcriptase et de la Protéase du VIH peuvent être détectées au moyen desdits procédés.

Le principe de la technique consiste à comparer les amplifications différentielles d'une PCR spécifique de mutation et une PCR totale, qui détecte toutes les séquences présentes. Le dosage peut utiliser le modèle généré à partir de la RT-PCR de l'ARN viral ou de PCR de l'ADN proviral de cellules infectées.

Pour l’Amplification, des mélanges d'amplification sont prévus, qui comprennent une sonde pour un usage dans une réaction de PCR en temps réel. Les mélanges peuvent ainsi comprendre une amorce sens, une amorce antisens et une sonde. Par exemple, un mélange d'amplification est prévu, comprenant une amorce sens ou un mélange d'amorces sens qui amplifie le 103N, 65R, 69T et 70R mutations, dans lequel le mélange comprend en outre un oligonucléotide ayant les nucléotides bien définis.

La détection d’une mutation ponctuelle sur la Reverse Transcriptase du VIH consiste en la transcription inverse de l’ARN extrait à l’aide d’un primer défini pour obtenir de l’ADNc. Ce dernier est mis en contact avec une amorce anti sens et un jeu d’amorces spécifiques pour amplifier le ADN virale contenant la mutation à rechercher.

Amplification

Tout comme la Protéase et la Reverse transcriptase, la reverse transcription et la première PCR ont été réalisées avec le Titan One tube RT-PCR Kit, Version 13. Le kit est commercialisé par Roche et contient : Titan Enzyme Mix, RNAse Inhibitor (5 U/l), dNTP Mix à 10mM (2,5mM pour chacun), Human Control RNA (2 pg/l), Control Primer Mix (20

M), H2O free, RT-PR Buffer (contenant du MgCl2 à 7,5 mM et du Dimethylesulfoxyde (DMSO)), DTT ou dithiothréitol à 100 mM, du MgCl2 (25 mM) en stock.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

Le Master Mix pour une réaction est préparé avec: Eau (24,5 l), RT buffer (10 l), dNTP (4 l), DTT (2,5 l), RNAse Inhibitor (1 l), Enzyme Mix (1 l) et les oligos: MJ3

(5’-AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’(2480-2499)) et MJ4

(5’-CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT-3’(3399-3420)) pour la Reverse transcriptase (1 l de chaque), 5’Prot1 (5’-TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC-3’(2082-2109)) et 3’Prot1 (5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG-3’(2703-2734)) pour la Protéase (1 l de chaque). Les primers alternatifs pour la Reverse transcriptase sont RT18 (5’-

GGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGG -3) et RT21 (5’-CTG

TATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3). Ceux de la Protéase sont 5’eprB (5’-AGAGCTTCAGGTTTGGGG-3) et 3’eprB (5’-GCCATCCATTCCTGGCTT-3’).

Le Mix est toujours prévu pour n+1 échantillons. Sous la hotte free ADN/ARN, la plaque 96 puits étant sur Eppendorf Cooler, le Mix est reparti dans les puits de la plaque à raison de 45 l, on y ajoute 10 l d’extrait d’ARN dans la chambre d’assemblage. Le volume total pour une réaction est de 55 l.

La reverse transcription et l’amplification ont été réalisées sur le thermocycleur 9700 (les temps sont adaptés au thermocycleur et à l’enzyme utilisée conformément au Kit TITAN). Il est allumé quelques minutes avant le lancement du run.

Conditions de la RT-PCR pour la Reverse Transcriptase et la Protéase: 1 cycle à 30 min à 50°C, 1 autre cycle à 94°C pendant 2 min. Puis: (30 sec à 94°C; 30 sec à 55°C; 1 min à 68°C) x 40 cycles et enfin 1 cycle à 68°C pendant 7mn et 4°C pour toujours.

PCR Nichée ou Nested PCR

Au total 10 l du produit de la première PCR sont utilisés dans 45 l du MMix2. Le kit employé pour la Nested PCR est “AmpliTaq ADN polymérase with GeneAmp 10X PCR BufferII MgCl2 solution”. Le Mix pour la Nested pour une réaction contient: dNTP à 1,25 mM (8,8 l), Tampon 10X (5,5 l), Eau free RNA (18,8 l), MgCl2 (25 mM), Taq

Polymérase (0,3 l) et les oligos à 20 mM: A35

TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’ (2530 to 2558)) et NE1 (35) (5’-CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT-3’(3300 to 3334)) pour la Reverse transcriptase et 5’prot2 (5’-TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA-3’ (2136 to 2163)) et 3’Prot2 (5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’ (2621 to 2650)) pour la Protéase (2,5 l de chaque oligo). Le Primers alternatifs pour la Nested de la Reverse transcriptase sont RT1 (5’- CCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGA -3) et RT4 (5’-

Chapitre II : Matériel et Méthodes

AGTTCATAACCCATCCAAAG-3). Pour la Protéase, c’est 5’prB (5’-GAAGCAGGAGCCGATAGACA-3’) et 3’prB (5’-ACTGGTACAGTTTCAATAGG-3’). Le volume total pour la réaction est de 55 l.

Conditions de la Nested pour la Reverse Transcriptase et la Protéase : 1 cycle à 94°C pendant 3 min, puis (30 sec à 94°C, 30 sec à 55°C, 1,30 min à 72°C) x 40 cycles et enfin 1 cycle à 72°C pendant 7 min; puis 4°C à l’infini.

Dépôt sur gel : l’électrophorèse sur gel d’agarose est utilisée pour déterminer les bandes spécifiques. Les produits de la Nested sont déposés sur gel d’agarose contenant du bromure d’éthidium à 4 %. Une bande est considérée comme spécifique si sa taille correspond à celle du contrôle aux alentours de 731 paires de base pour la Reverse Transcriptase et 507 pour la Protéase. Le contrôle de poids moléculaire utilisés est le Tacklt ^TM X174 RF ADN/Hae III fragment qui a un intervalle de 72 à 1 353 paires de bases.

Purification des produits de la réaction de séquençage

La résine de Sephadex G-50 est utilisée pour la purification du produit de séquençage.

Elle permet de dé-saler les échantillons, d’éliminer les nucléotides non incorporés et les amorces en excès. La limite d’exclusion est d’environ 20 bases. La plaque 96 Nucleo Fast 96 de Machery Nagel est utilisée comme support inerte à la résine de Sephadex G.

Le principe est celui d’une chromatographie par gel filtration qui consiste en la séparation des composés en fonction de leur poids moléculaires. En fonction de la dimension des pores du gel, les composés qui sont en trop dans le mélange (excès d’amorces, de didésoxyribonucléotides, les sels) sortiront en premier. Le produit issu de la réaction de séquence sera incorporé dans la colonne puis extraits à l’aide d’un tampon d’élution.

Détection des mutations de résistances

Le protocole de l’ANRS (ANRS AC 11 Resistance Study Group/PCR and Sequencing Procédures: HIV-1/Version de février 2008: http://www.hivfrenchresistance.org/) est utilisé pour le séquençage. L’analyse des séquences et la détection des mutations des résistances sont faites en utilisant le site de Stanford University/HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu/). L’interprétation des résultats est effectuée conformément à l’algorithme de l’ANRS AC11 révisé en septembre 2013 (N°23).

Chapitre II : Matériel et Méthodes