NOUVELLES APPROCHES GENOTYPIQUES POUR LE MONITORING DE RESISTANCE DU VIH AUX ARV DANS LES PAYS A RESSOURCES LIMITEES : CAS DU TCHAD

NOUVELLES APPROCHES GENOTYPIQUES POUR LE MONITORING DE RESISTANCE DU VIH AUX ARV DANS LES PAYS A RESSOURCES LIMITEES :

CAS DU TCHAD

Chatté Idékhim ADAWAYE Matricule : s105285

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Soutenue publiquement le 1^er décembre 2014

Jury :

 Danièle SONDAG-THULL Université de Liège (Présidente)

 Michel MOUTSCHEN Université de Liège (Promoteur)

 Souad RAHMOUNI Université de Liège (Secrétaire)

 Carole DEVAUX CRP-Santé de Luxembourg

 Jacques PIETTE Université de Liège

 Jean RUELLE Université Catholique de Louvain

 Nathalie JACOBS Université de Liège

 Patrick DE MOL Université de Liège Année Académique 2014-2015

Université de Liège Faculté de Médecine

Laboratoire de Référence Sida

Entre, ce que je pense, ce que je veux dire, ce que je crois dire, ce que je dis, ce que vous avez envie d’entendre,

ce que vous croyez entendre, ce que vous entendez, ce que vous avez envie de comprendre, ce que vous croyez comprendre, ce que vous comprenez, il y a dix possibilités qu’on ait des difficultés à communiquer.

Mais essayons quand même…

Bernard Werber: Encyclopédie du savoir relatif et absolu.

Table des matières

Table des matières

Dédicaces ... v

Remerciements ... vi

Liste des sigles et abréviations ... ix

Liste des tableaux ... xi

Liste des figures ... xii

Résumé ... xiii

CHAPITRE I - Introduction Générale ... 1

I. Contexte et justification du sujet ... 1

II. Généralités sur le VIH et le Sida... 5

2.1 Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) ... 5

2.2 La diversité génétique des groupes et sous-types du VIH ... 5

2.3 La situation du VIH/SIDA au Tchad ... 7

2.4 Le monitoring biologique pour la prise en charge de l’infection à VIH ... 9

2.4.1 Evaluation des signes cliniques ... 9

2.4.2 Mesure des lymphocytes CD4 ... 10

2.4.3 Mesure de la charge virale ... 11

2.4.4 Tests de résistance: le phénotypage (antivirogramme) et le génotypage ... 12

2.5 Les mécanismes d’action des antirétroviraux ... 15

2.5.1 Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse (INTI) 15 2.5.2 Inhibiteurs Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INNTI) ... 16

2.5.3 Inhibiteurs de la Protéase (IP) ... 16

2.5.4 Inhibiteurs d’Intégrase ... 17

2.5.5 Inhibiteurs d’entrée ... 17

2.6 La problématique et les mécanismes de résistance du VIH aux ARV ... 18

2.6.1 Problématique de la résistance du VIH aux ARV ... 18

2.6.2 Mécanisme de résistance du VIH aux INTI ... 20

2.6.3 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux INNTI ... 21

2.6.4 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux IP ... 21

2.6.5 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux anti intégrases ... 22

2.6.6 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs d’entrée (de fusion) ... 22

2.6.7 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs de CCR5 ... 22

III. But, hypothèses, objectifs et plan du travail ... 23

3.1. Le but de l’étude ... 23

3.2. Les hypothèses de recherche ... 23

3.3. L’objectif général ... 23

3.4. Les objectifs spécifiques ... 23

3.5. Le plan du travail ... 24

CHAPITRE II- Matériel et méthodes ... 34

II.1 Le matériel ... 34

Table des matières

2.1.1 Matériel de collecte des données ... 34

2.1.2 Matériel de prélèvement ... 34

II.2 Les méthodes ... 34

2.2.1 Site de l’étude... 34

2.2.2 Description du site de l’étude ... 34

2.2.3 Type d’étude ... 35

2.2.4 Durée de l’étude ... 35

2.2.5 Taille de l’échantillon ... 35

2.2.6 Méthode d’échantillonnage ... 35

2.2.7 Critères d’inclusion ... 36

2.2.8 Critères d’exclusion ... 36

2.2.9 Procédure de recueil des données ... 36

2.2.10 Procédure de collecte des échantillons ... 36

2.2.11 Procédure d’analyse des échantillons ... 37

2.2.11.1 Mesure des lymphocytes TCD4 ... 37

2.2.11.2 Mesure de la charge virale ... 37

2.2.11.3 Techniques d’amplification et de détection des mutations de résistance ... 39

2.2.11.4 Détections des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR) ... 43

2.2.12 Traitements des données et analyses statistiques ... 47

2.2.13 Conditions éthiques ... 47

CHAPITRE III- Evaluation Immunovirologique du traitement antirétroviral ... 50

3.1. Introduction ... 50

3.2. Caractéristiques générales de la population d’étude ... 50

3.3. Méthodologie ... 51

3.4. Résultats originaux ... 51

3.5. Résumé des résultats du chapitre III ... 54

CHAPITRE IV- Comparaison des techniques de mesures de la charge virale ... 62

4.1. Introduction ... 62

4.2. Méthodologie ... 63

4.3. Résultats originaux ... 66

4.4. Résumé des résultats du chapitre IV ... 70

CHAPITRE V- Utilisation du Dried Blood Spot (DBS) pour le monitoring biologique . 73 5.1. Introduction ... 73

5.2. Méthodologie ... 73

5.3. Résultats originaux ... 74

5.4. Résumé des résultats du chapitre V ... 76

CHAPITRE VI. Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique ... 79

6.1. Introduction ... 79

6.2. Méthodologie ... 80

6.3. Résultats originaux ... 81

6.4. Résumé des résultats du chapitre VI ... 91

Table des matières

CHAPITRE VII- Détection des mutations de résistance ponctuelles (ASPCR) ... 94

7.1. Introduction ... 94

7.2. Méthodologie ... 95

7.3. Résultats originaux ... 95

7.4. Résumé des résultats du chapitre VII ... 103

Discussion générale ... 104

Conclusion générale ... 117

Perspectives d’avenir ... 120

Liste bibliographique ... 121

Les annexes ... 138

Dédicaces

Dédicaces

Ce travail est dédié à :

Mon cher papa Chatté Idékhim, papa, c’est l’occasion pour moi de te remercier pour tous les sacrifices que tu as déployés à l’égard de tes fils. Toi qui as pu nous former et diriger nonobstant les moyens limités en traversant toutes les vicissitudes de la vie ; voici venu le moment de profiter du fruit de ce travail qui a été possible grâce à ton amour et tes prières.

Qu’ALLAH te bénisse et t’accorde une longue vie.

Ma chère maman Djimié Abdelkerim, maman, toi qui m’as donné la vie, toi qui m’as allaité, toi qui as gouverné mes premiers pas, je pense à toi. Qu’Allah te bénisse maman et te prête longue vie. Pour tous les sacrifices consentis à mon égard, trouve ici l’occasion de réjouissance maman.

Mon grand frère Abderahmane Chaté, tu as pu m'accompagner dans chaque épreuve, comme tu l'as fait à chaque étape de ma vie. C'est un peu fou à dire, mais après toutes ces années, je réalise vraiment ce que signifie avoir un frère et je me sens moins seul de te savoir là. La valeur que tu m’accordes à chaque instant m’a aidé à grandir. Tu as été pour nous tes frères un père et un exemple à suivre. Nos différences ne sont pas si importantes au fond, et nous sommes toujours, à nous tous, une famille aimable. Que ce travail fasse ta fierté.

Mon épouse Rabha Al-Adaouia Mahamat Doungous, merci pour ton soutien de tout genre et merci d’avoir supporté mon absence auprès de toi durant ma formation.

Mes frères et sœurs : Nouracham, Abdelkerim, Abdelaziz Abdelsalam, Allamine, Khadidja, Yaman, Mahamout et Abdelsamat, vous qui avez fait toujours de ma réussite votre première préoccupation, c’est l’occasion pour moi de vous exprimer ma profonde gratitude pour les sacrifices que vous avez toujours consentis pour ma formation. Merci encore pour vos prières, encouragements, conseils et votre soutien. Feue ma tante Adjiti et feue ma petite sœur Adjiti, vous qui nous avez quitté très tôt sans goutter le fruit de votre soutien et votre encouragement. Qu’Allah vous accorde le paradis.

A tous mes oncles, tantes, cousins, cousines, neveux et nièces, ce travail est aussi le

fruit de votre soutien tout au long de ma formation. Ne vous laissez pas surprendre par le

temps, sachez que la clé de la réussite passe par la patience, la volonté et le travail.

Remerciements

Remerciements

En préambule de cette thèse, qu’il me soit permis de présenter tout d’abord mes louanges à Allah Le Tout Puisant, Le Très Miséricordieux pour Ses bienfaits pour m’avoir donné la santé et la force nécessaires afin de mener à bien cette formation.

Il serait ingrat de ma part d’écrire ce document sans avoir une pensée à toutes les personnes qui m’ont apporté de l’aide et de l’assistance nécessaires à l’élaboration de ce travail.

Je tiens à remercier sincèrement le Professeur Michel Moutschen qui, en tant que Directeur de thèse, a toujours été à l'écoute et très disponible tout au long de la réalisation de ce document. Merci pour l'inspiration, l'aide et le temps qu'il a bien voulu me consacrer et sans qui cette thèse n'aurait jamais vu le jour. Sa rigueur au travail, son dynamisme et ses conseils éclairés m’inspirent une profonde reconnaissance à son égard. Je tiens à le remercier non seulement d’avoir accepté de diriger ce travail mais aussi d’avoir mis à ma disposition toutes les ressources nécessaires pour sa réalisation.

Je voudrais remercier aussi Dolorès Vaira, responsable du Laboratoire de Référence Sida. Elle a été pour moi non seulement une formatrice mais aussi une mère durant toute ma formation. Qu’elle reçoit ici tous mes remerciements pour les conseils, l’encadrement et la disponibilité qu’elle a consentis à mon égard. C’est le moment de lui exprimer ici ma profonde reconnaissance pour le goût de l’effort et le sens du travail bien fait qu’elle n’a cessé de m’insuffler.

Un grand merci au Professeur Danièle Thull Sondag, présidente du comité de thèse et à tous les autres membres du comité. Merci pour l’encadrement et les orientations durant ma formation.

J’exprime ma gratitude à tous les membres du jury qui ont accepté de juger ce travail

et d’apporter leur contribution scientifique. Qu’ils acceptent ici, l’expression de mon plus

profond respect.

Remerciements

Mes remerciements vont également :

Aux autorités administratives et communales du Royaume de Belgique de m’avoir accepté/accueilli parmi les leurs.

Aux responsables universitaires et hospitaliers, merci de m’avoir permis de suivre cette formation de qualité dans cette prestigieuse institution qu’est le CHU de Liège.

Au Professeur Pascal Leroy, Doyen de la Faculté de Médecine vétérinaire et Consul Honoraire du Tchad à Liège, qui a été mon parrain ici à Liège et n’a ménagé aucun effort avec son collègue le Professeur M. Moutschen pour que je puisse être accepté à l’ULg.

J’aimerais tout simplement leur dire, merci pour tout.

Au Professeur Mahamoud Youssouf Khayal, qui m’a toujours conseillé et soutenu durant mes études supérieures ; qu’il trouve ici l’expression de mes sincères remerciements.

A Malloum Soultan, Directeur Général de l’Institut Universitaire des Sciences et Techniques d’Abéché (IUSTA). Votre bon sens et votre abnégation dans le travail m’ont permis d’achever cette formation dans de bonnes conditions.

A Issa Youssouf Adoum et Aoudalkarim Moussa Chahad, pour les précieux conseils et les encouragements. Merci aussi pour avoir lu et corrigé ce document.

A Sébastien Bontems, responsable de l’assurance qualité pour le laboratoire de Microbiologie. Il m’a toujours aidé à imprimer mes papiers. Mes articles ont rempli sa boite mail et je suis sûr que j’ai une bibliothèque de réserve auprès de lui. Merci pour les précieux conseils, la disponibilité et encadrement.

A Raphaël Boreux, spécialiste de la PCR en temps réel. Merci de m’avoir appris les différentes techniques de PCR en temps réel sur différentes machines.

A mes collègues et amis Kamangu Erick et Fokam Joseph avec qui j’ai eu l’opportunité de travailler et de discuter sur des sujets très pertinents.

A Fabrice Susin, Jonathan Meganck, Giuseppina Oliveri et Adjitey Caroline. Je leur ferais arracher le sourire à cette équipe dynamique du LRS si je leur parlais du marqueur de poids moléculaire PHIX174 RF ADN HaeIII ou s’il fallait lire l’écriture « wastle bottle ».

Nous avons travaillé dans une ambiance bon enfant, mais cela ne nous a pas fait perdre de

Remerciements

vue la rigueur scientifique au travail bien fait. Leur contribution de tout genre à ce travail est remarquable. Ils ont été gentils avec moi en me montrant beaucoup de choses. Je leur exprime ma profonde gratitude pour l’effort consenti par tous. Merci aussi pour la pizza- party de chaque fin de séjour.

A Francesca Lipari et Emilie Guissart, Secrétaires du Service d’Immunologie et des Maladies Infectieuses, pour leur gentillesse, leur disponibilité et leur collaboration. Qu’elles reçoivent ici ma profonde reconnaissance.

Un merci sincère et véritable à Jessica Monfort pour avoir sacrifié son temps afin d’apporter des corrections pertinentes à ce travail.

Un grand merci aux compatriotes tchadiens de Liège pour la bonne cohabitation durant cette formation. Je pense à Acheikh Ali Annadif, Issakha Alnadjib Senoussi, Brahim Tchou, Youssouf MS Annadif, Abdelkhani Ezedine, Elhadj Adam, Haroun Hamat et Oumar Souelymane.

A tous les PVVIH qui ont accepté de donner leur sang afin que cette étude ait lieu.

Que ce travail vous apporte réconfort et plein courage de vivre une vie normale.

Je n’oublie pas le personnel du laboratoire de Microbiologie du CHU de Liège pour leur collaboration. Un grand merci aussi au personnel du laboratoire de l’Hôpital Général de Référence National de N’Djaména (HGRN) d’avoir facilité la collecte des données.

Enfin, je tiens à remercier tous ceux que je n’ai pas cités dans ce travail et qui m’ont

apporté leur aide dans toute dimension ; qu’ils reçoivent ici tous mes remerciements.

Sigles et abréviations Liste des sigles et abréviations

3TC Lamivudine

ANRS Agence Nationale pour la Recherche sur le Sida ARMS Amplification Refactory Mutation System ARV Antirétroviral (aux)

ASPCR Allele-Specific Polymerase Chain Reaction AZT (ZDV) Zidovudine

bp paire(s) de bases

CAP/CTM Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan CD4 Cluster of Differentiation 4

CHU Centre Hospitalier et Universitaire CNLS Centre National de Lutte Contre le Sida

d4T Stavudine

DBS Dried Blood Spot

ddc Zalcitabine

ddl Didanosine

DNA/ADN Desoxyribonucleic Acid/ Acide Désoxyribonucléique DPS Dried Plasma Spot

EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétique

EFZ Efavirenz

ENV Enveloppe FTC Emtricitabine

GAG Group Antigen Gene

HAART High Active Antiretroviral Therapy HGRN Hôpital Général de Référence Nationale

INNTI Inhibiteurs Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

INTI Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse LRS Laboratoire de Référence Sida

LTR Long Terminal Repeat Min Minute

MMix Master Mix

NVP Névirapine

Sigles et abréviations

OMS Organisation Mondiale de la Santé

ONUSIDA Organisation des Nations Unies Pour la Lutte contre le SIDA PCR Polymerase Chain Reaction

PI Protease Inhibitors POL Polymérase

PRL Pays à Ressources Limitées

PTME Prévention de la Transmission Mère-Enfant PVVIH Personne Vivant avec le VIH

RNA Ribonuicleic Acid

Sec Seconde

SIDA Syndrome de l’Immunodéficience Acquise TAR Traitement Antirétroviral

TDF Ténofovir

TDR Test de Dépistage Rapide ULg Université de Liège

VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine

WHO World Health Organisation

Liste des tableaux Liste des tableaux

Tableau 1: Classification de la maladie à VIH/ stades cliniques OMS ... 10

Tableau 2: Comparaison des différentes techniques de mesure de la charge virale ... 12

Tableau 3: Préparation du MMix 1: Annealing ... 44

Tableau 4: Préparation du Master Mix 2: Enzyme Mix ... 44

Tableau 5: Preparation du premier Master Mix pour ASPCR ... 46

Tableau 6: Préparation du second MMix pour ASPCR ... 47

Tableau 7: Valeurs observées des CD4 avant et après traitement ... 52

Tableau 8:Valeurs des charges virales observées avant et après traitement ... 52

Tableau 9: Mutations de résistance détectées sur plasma vs DBS ... 74

Tableau 10: Comparison des sous-types détectés sur plasma vs DBS ... 75

Tableau 11: Nombre de patients par rapport au traitement administré ... 82

Tableau 12: Valeurs charges virales sur CAP/CTM vs Abbott RealTime ... 82

Tableau 13: Nombre de patients en échec par rapport au traitement administré ... 83

Tableau 14: Distribution des sous-types et des mutations de résistance chez les patients en echec sous Triomune ... 83

Tableau 15: Distribution des sous-types et mutations de résistance chez les patients en echec sous Duovir N ... 85

Tableau 16: Distribution des patients par rapport aux sous-types ... 87

Tableau 17: Quantification de la résistance du VIH au traitement (Stanford) ... 90

Tableau 18: Coefficients de variation intra et inter-essais ... 99

Tableau 19: Mutations de résistance détectées par ASPCR (Plasma) ... 100

Tableau 20: Comparaison des mutations de résistance en fonction des sous-types détectés par ASPCR vs plasma ... 101

Tableau 21: Evaluation de la sensibilité de l'ASPCR par rapport au séquençage sur DBS vs plasma ... 102

Tableau 22: Distribution des mutations de résistances détectées par ASPCR par rapport aux

sous-types détectés sur DBS ... 103

Liste des figures Liste des figures

Figure 1: Principe du séquençage selon la méthode de Sanger ... 14

Figure 2: Distribution des tranches d'âge par rapport au sexe ... 50

Figure 3: Nombre des patients par rapport au traitement administré ... 51

Figure 4: Répartition des patients en échec par rapport au traitement ... 53

Figure 5: Comparaison CAP/CTM et Abbott RealTime ... 67

Figure 6: Résultats de mesures CAP/CTM et Abbott RealTime ... 67

Figure 7: Comparaison CAP/CTM et ANRS ... 68

Figure 8: Comparaison Abbott RealTime et ANRS ... 69

Figure 9: Courbes de mesure entre CAP/CTM V2.0, ANRS et Abbott RealTime ... 69

Figure 10: Fréquence des mutations de résistance associées aux INTI ... 88

Figure 11: Fréquence des mutations de résistance associées aux INNTI ... 89

Figure 12: Arbre phylogénétique des séquences de la protease (plasma) ... 91

Figure 13: Courbes standard des différences des Ct (sauvage-muté) pour les différentes mutations ... 96

Figure 14: Courbes standard avec le primer générique et muté des différentes dilutions ... 97

Figure 15: Exemple de la courbe d'amplification (générique et sauvage) avec différences des Ct pour la K103N ... 97

Figure 16: Quantifications des mutations de resistance détectées par ASPCR vs plasma ... 102

Résumé

Résumé

Introduction

La lutte contre le VIH demeure jusqu’à présent un problème majeur de santé publique dans les pays au sud du Sahara et ce, malgré les avancées notables enregistrées depuis quelques années. Les ressources limitées pour la prise en charge des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) dans ces pays ont pour conséquence l’émergence et la transmission des souches résistantes qui se traduit par la perte de l’efficacité du traitement administré.

Un traitement antirétroviral est administré dans l’objectif d’obtenir et de maintenir une charge virale plasmatique indétectable, tandis que la prise en charge d'une situation d'échec virologique (première ligne, lignes ultérieures ou multi-échecs) implique le plus souvent une adaptation du traitement en fonction des résultats, le contrôle régulier de la charge virale et des tests génotypiques de résistance. Or, la performance d’un test de résistance est influencée par ses propriétés intrinsèques (sensibilité et spécificité), la qualité et le type de l’échantillon à analyser, la connaissance de la prévalence de résistance et de la diversité génétique dans la population. En tout état de cause, les techniques de mesure de la charge virale et les tests de résistance standard nécessitent des infrastructures de laboratoire adéquats et du personnel bien formé. Toutes ces méthodes, pour utiles qu’elles soient, se révèlent être inadaptées sinon très onéreuses pour les pays à ressources limitées (PRL). C’est la raison pour laquelle, le développement et la mise en place au Tchad des nouvelles alternatives, fiables et moins coûteuses seraient à notre avis, la solution pour une meilleure surveillance épidémiologique de la résistance du VIH au traitement.

Objectifs

Etant donné que les tests de résistance ne sont pas encore disponibles au Tchad ; et

afin de pouvoir aider les cliniciens sur leur prise de décision et contribuer à un meilleur suivi

des personnes vivant avec le VIH (PVVIH), nous nous sommes fixés comme objectif général

d’évaluer et de mettre en place des méthodes alternatives pour le monitoring biologique de la

résistance du VIH aux ARV au Tchad. L’atteinte de cet objectif général, passe nécessairement

par la réalisation d’objectifs spécifiques qui sont: 1) Faire une évaluation immunovirologique

avant et après traitement. 2) Quantifier la charge virale et évaluer les différentes techniques

disponibles. 3) Identifier chez ces sujets les différentes mutations de la Reverse Transcriptase

et de la Protéase associées à la résistance du virus et en évaluer la prévalence sur DBS et

Plasma. 4) Evaluer la technique ASPCR afin de détecter les mutations ponctuelles associées à

Résumé

la résistance du VIH-1 pour les sous-types non-B. 5) Déterminer la prévalence de la résistance acquise et la diversité génétique des sous-types du VIH-1 circulants à N’Djamena.

Méthodologie

Notre échantillon est constitué de 116 patients (78 femmes et 38 hommes représentant respectivement 67,24 % et 32,76 %). Ces patients sont recrutés sur base des critères d’inclusion et d’exclusion bien définis. La moyenne d’âge de nos patients est de 41 6,87 ans avec 84 ans pour le plus âgé et 17 ans pour le plus jeune. Deux types d’étude sont utilisés:

l’une traversable (prospective et rétrospective) et l’autre expérimentale. L’échantillonnage est de type consécutif non exhaustif (tout venant). L’échantillon utilisé est le sang veineux prélevé sur EDTA au pli du coude. Le plasma est aliquoté dans des cryotubes et conservé à - 80°C; 75 µl du sang total sont déposés sur papier buvard de type Whatman 903 (Whatman, Maidstone, UK). La charge virale est évaluée à l’aide des trois techniques: Abbott RealTime, Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) v2.0 et la technique de l’ANRS. La conservation du DBS est faite à -20 °C jusqu’au transport en Belgique pour les analyses.

L’extraction de l’ARN viral est faite avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit. Nous avons recouru à la technique de l’ANRS (ANRS AC11 Resistance Study Group, 2008) pour réaliser le séquençage sur la Réverse Transcriptase et la Protéase sur un total de 30 DBS.

En vue d’évaluer la réponse immunvirologique des PVVIH sous ARV et suivre l’évolution de l’infection vers le stade SIDA à travers les deux marqueurs principaux qui sont les lymphocytes TCD4 et la charge virale, nous avons effectué le suivi des 116 patients pendant huit mois. Ces deux marqueurs sont mesurés avant le traitement (Jour 0) et après huit mois de traitement. Les moyennes des CD4 et de la charge virale au J0 sont comparées aux valeurs obtenues après 8 mois de traitement. Ensuite, concernant les patients sous Triomune, ceux-ci ont fait l’objet d’une évaluation particulière pour déterminer le taux d’échec à la Triomune.

Les méthodes d’amplification et de détection employées sont celles décrites dans la

procédure du groupe de résistance de l’ANRS AC11 (ANRS AC11 Resistance Study Group,

2008). L’amplification des régions concernées de la polymérase (Protéase et Reverse

Transcriptase) a été réalisée avec le Titan One tube RT-PCR Kit, Version 13 (Boehringer

Mannheim, Manneheim, Germany). La technique ASPCR (Allele-Specific PCR) est utilisée

pour la détection des mutations de résistances ponctuelles sur DBS et le plasma. Les

séquences de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont alignées avec le logiciel Bioedit

Résumé

(version 7.2.5) et sur CLUSTAL W version 1.7 (Thompson, Higgins, & Gibson, 1994). Les séquences obtenues de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont comparées à la banque des sous-types non-B disponibles dans Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov/). Les sous- types, les formes recombinantes et les mutations de résistance sont obtenus après analyse des séquences sur le site de Stanford University/HIV Drug Résistance Database (http://hivdb.stanford.edu/). Les résistances sont interprétées conformément à l’algorithme de l’ANRS AC11, révisé en septembre 2013 (http://www.hivfrenchresistance.org/). Afin d’autoriser des taux de mutations différents le long des branches, nous avons eu recours à la « Neighbor Joining », méthode du plus proche voisin en vue de construire l’arbre phylogénétique sur MEGA 5.2.2.

Résultats

En évaluant les paramètres immunovirologiques, nous avons remarqué que la médiane des charges virales observée avant le traitement est loin d’être la même après huit mois de traitement (5000 vs 51; U de Mann-Whitney significatif à p < 0,001 pour les deux médianes).

Par contre la moyenne au J0 n’a pas significativement changée au M8 (44739 vs 43460 ; p >

0,05). La moyenne des CD4 n’a pas considérablement fluctué chez les 116 patients avant et après 8 mois de traitement (309 vs 344 ; p = 0,62). La médiane des CD4 au J0 est de 248 alors que celle de M8 est de 298,5 (p = 0,75). Le taux d’échec à la Triomune est de 43,75 % (21/48). L’étude ne relève également, aucune différence significative entre le taux d’échec et le sexe (p > 0,05).

La corrélation entre la mesure de la charge virale sur CAP/CTM et Abbott RealTime est excellente avec R

= 0,96016. Si la mesure avec la technique de l’ANRS semble être discordante des deux premiers tests, il n’empêche que la corrélation soit bonne avec R

= 0,72603 pour CAP/CTM-ANRS et R

= 0,81064 pour Abbott-ANRS. Un « blip » est observé sur deux échantillons (2,23 et 2,68 Log10 copies/ml) avec la version 2.0 du Cobas. La dégélation du plasma lors de la mesure avec la technique ANRS pourrait être à l’origine des valeurs sous estimées obtenues comparativement à Abbott RealTime et le Cobas.

L’analyse nucléotidique des 44 échantillons indique la présence des sous-types suivants : A = 4 (9,30 %), D = 4 (9,30 %), F = 2 (4,65 %), G = 7 (16,28 %) et J =13 (30,23

%). La seule forme recombinante que nous avons trouvée dans l’étude est CRF02_AG chez

13 patients, soit 30,23 %. Un échantillon était indéterminé après analyse des séquences. Il

ressort de cette étude qu’il y a présence d’un nouveau sous-type J qui circule à

Résumé

N’Djaména avec un taux de 30,23 % (13/43); il est apparenté au sous-type F après analyse phylogénétique.

Sur DBS, nous avons obtenu un taux d’amplification de 80 % (24/30). La limite de détection est de 3,33 log10, ce qui équivaut à 2150 copies/ml. Le CRF02_AG est également le plus représenté sur DBS (29,17 %; 7/24) comme sur le plasma (30,23 %; 13/43). Le sous-type K est présent (3/24; 12,5 %) sur DBS sur la Reverse Transcriptase alors qu’il est absent dans le plasma.

Concernant les Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse (INTI), les principales mutations enregistrées sont la M184V/I/L qui est largement rencontrée chez 30 patients sur les 43, soit 69,77 %; la T215Y/F/I/S enregistrée chez 13 autres patients (soit 30,23 %). D’autres mutations communes (A62V, V75I/L, M184V/I) ont aussi été constatées chez deux patients, à hauteur de 4,65 %. Les analogues à la thymidine (TAMs) sont représentées par la T215Y/F, la K70P/R/W et la K219E/N/Q respectivement à concurrence de 30,23 % (13/43), de 9,30% (4/43) et de 9,30 % (4/43). Les résistances que nous avons remarquées pour les INNTI sont représentées par la K103N/S/E chez 13/43 (30,23

%) et la Y181C/V/F/L chez 11/43 (25,58 %). Comme nous pouvions nous attendre dans le cas des INNTI, nous avons noté l’association Y181C/F et K103N chez 3/43 (6,98 %).

Certaines mutations telles que L100I, F227L et P225H ne sont constatées que chez un seul patient à hauteur de 2,33 %.

S’agissant de la quantification des résistances, nous avons observé qu’il existe une résistance élevée aux INNTI chez plus de la moitié des patients, avec 74 % (32/43) pour la NVP et 55,8 % (24/43) pour l’EFZ. Pour les INTI, nous avons noté une forte résistance à la 3TC à hauteur de 67,5 % (29/43).

Pour la détection des mutations ponctuelles, une spécificité de 10 % est obtenue avec l’ASPCR comparativement au plasma. Pour les sous-types D, il s’agit de la Y181C; pour le sous-type J, de laY181C et de la M184V et pour le CRF02_AG, de la Y181C et de la M184V.

L’ASPCR est une méthode fiable de détection de mutation de résistance ponctuelle mineure à hauteur de 0,01 %. Elle est la méthode de choix pour la détection des mutations de résistance mineures dans un échantillon; les coefficients de variation en intra et inter-essais sont tous inférieures à 0,50. Cela montre que l’estimation de la technique est plus précise.

Le taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) est de 56,9 % (66/116). La

prévalence de la résistance parmi les individus ayant une CV ≥ 1000 copies/ml est de 74 %

Résumé

(37/50) alors que celle de la résistance acquise chez tous les patients est donc de 31,9 % (37/116).

Conclusion

Promouvoir la collecte des échantillons sur DBS, c’est une manière de résoudre en

partie la problématique liée à la conservation de l’échantillon. Ainsi, le suivi de l’efficacité

d’un traitement bien régulié, bien toléré et bien observé passe nécessairement par un contrôle

immunovirologique constant et des tests de résistances. Plusieurs mutations associées à la

résistance aux ARV à différents niveaux sont présentes chez les PVVIH à N’Djamena

occasionnant dès lors l’échec au traitement et l’apparition des souches résistantes dans la

population. La présence de ces mutations serait liée à la mauvaise observance notifiée dans

l’étude (80 %; p < 0,05). Pour la mesure de la charge virale, la technique de l’ANRS semble

être la plus simple et la moins onéreuse ; mais pour les pays à ressources limitées,

l’application de cette technique nécessite un personnel qualifié et des infrastructures de

laboratoire suffisants. La Triomune ne doit pas être utilisée comme traitement de première

intention à cause de l’échec immunovirologique relatif à son utilisation. Nous osons croire

enfin, que l’approvisionnement régulier en molécules antirétrovirales, l’adéquation des

infrastructures de laboratoire et la formation continue du personnel technique dans les PRL,

paraissent l’une des options fiables pour réduire au maximum le risque d’émergence de

résistance du VIH.

Chapitre I : Introduction Générale

Chapitre I

Introduction Générale

Chapitre I : Introduction Générale

CHAPITRE I - Introduction Générale I. Contexte et justification du sujet

Plusieurs années après sa découverte, le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) reste encore une des causes majeures des décès dans le monde et c’est l’Afrique Subsaharienne qui en paye le lourd tribut. Parmi les 35,3 millions [32,2-38,8] de personnes qui vivent avec le VIH dans le monde en fin 2012, près de 69 % résident en Afrique Subsaharienne, une région qui ne représente que 12 % de la population mondiale (Onusida, 2013). Malgré les avancées thérapeutiques pour la lutte contre le Sida, l’émergence de la résistance aux antirétroviraux dans les pays à ressources limitées se révèle être l’un des problèmes majeurs de la thérapeutique antirétrovirale. C’est ainsi que divers sous-types de virus circulent en Afrique Centrale et sont responsables d'environ 85 % des nouvelles infections, dont les plus fréquents sont A (A1, A2, A3, A4, A5), C, CRF02_AG et D.

Récemment, un nouveau groupe putatif désigné P a été retrouvé chez deux patients camerounais (Lihana et al., 2012; Plantier et al., 2009).

A l’instar des autres pays, au Tchad, la pandémie du Sida fait de nombreux décès chaque année. La prévalence chez la population tchadienne de 15 à 45 ans, estimée à 7 millions d’habitants en 2005 est de 3,3 % (Ouagadjio et al., 2005). Le type de VIH qui circule au Tchad depuis l’avènement du SIDA est le VIH-1. A notre connaissance, jusqu’à présent, une seule étude, publiée en 2003 renseigne sur les différents groupes du VIH-1 qui circulent au pays. Parmi ces groupes, seul le M avec les 4 sous-types (A, D, F et G) et trois recombinants (CRF01-AE, CRF02-AG et CRF11-cpx) est majoritairement retrouvé. Le groupe O est minoritaire et le N n’a pas été rencontré. De même, des cas de VIH-2 n’ont pour l’heure pas été observés au Tchad (Vidal et al., 2003).

Cette situation a conduit le gouvernement tchadien à réévaluer les priorités nationales

en matière de santé, et plus particulièrement à se concentrer sur les difficultés qu’affrontent

les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) et d’origine tchadienne, personnes qui ont souffert

depuis longtemps d’un manque d’accès à l’éducation et à des soins de santé appropriés. Afin

de relever ces défis, le Gouvernement du Tchad, avec le concours de bailleurs de fonds

extérieurs, a élaboré en 1998, une stratégie nationale de la santé ainsi qu’un plan national

stratégique de lutte contre le SIDA. C’est pourquoi, depuis 2007, le Gouvernement tchadien a

instauré la gratuité des antirétroviraux (ARV) et tous les examens complémentaires afférents à

Chapitre I : Introduction Générale

l’infection à VIH. Depuis lors, un protocole de traitement basé sur une trithérapie a vu le jour.

Cette trithérapie était fondée sur la Triomune (Cipla-Inde) jusqu’à fin 2012, année au cours de laquelle, elle fut abandonnée non seulement à cause de ses effets secondaires, mais aussi à cause de l’échec immunovirologique associé à son utilisation (Adawaye et al., 2014). Les molécules d’actualité sont aujourd’hui au Tchad le Duovir N (AZT, 3TC et NVP) et le Viraday ou Atripla (FTC, TDF et EFZ). Depuis lors, ces molécules n’ont fait l’objet d’aucune évaluation dans le pays; c’est pourquoi, pour vérifier leur efficacité, un monitoring biologique régulier s’impose.

Problématique

Un traitement antirétroviral quelle que soit la situation thérapeutique du patient est administré dans l’objectif d’obtenir et de maintenir une charge virale plasmatique indétectable (Palella et al.,1998) sinon inférieure à 50 copies/ml (Hocini & Andreoletti, 2009). La charge virale permet d’apprécier l’évolutivité de la maladie en complément de la mesure des CD4 et de l’appréciation des signes cliniques. Ces résultats doivent en tout état de cause être confrontés au taux de CD4 et aux signes cliniques, le dialogue clinicien-biologiste reste primordial pour l’interprétation des résultats (Hocini & Andreoletti, 2009).

Ces indicateurs biologiques, pour utiles qu’ils soient, s’avèrent être très rares dans les pays à ressources limitées (PRL), en raison des coûts élevés des différentes techniques et des exigences strictes pour le stockage et le transport du plasma. Pourtant ces indicateurs présentent des sérieuses limites dès lors qu’il s’agit de mettre en place des moyens de suivi permettant de faire évoluer les traitements pour les patients en situation d’échec et de résistance aux traitements (Johannessen et al., 2009; Palella et al., 1998). Ainsi donc, l’OMS recommande que l’échec virologique soit évalué par les signes cliniques ou par la mesure des taux des CD4 pour les PRL (Hirsch et al., 2008), bien que ces derniers aient une faible sensibilité et spécificité dans l’évaluation de l’échec virologique (D. E. Bennett et al., 2009).

De manière générale, les méthodes standards de l’évaluation du traitement et de l’évolution de la maladie nécessitent le cas échéant des techniques et des exigences strictes pour le stockage et le transport du plasma, du personnel qualifié et les infrastructures d’un laboratoire de biologie moléculaire (Johannessen et al., 2009). Le coût élevé et la complexité de toutes ces méthodes les rendent inadaptées pour les PRL et notamment pour le Tchad.

Cette situation nous a amené à poser la question de savoir « Quelles pourraient être les

Chapitre I : Introduction Générale

approches alternatives pour le monitoring de résistance du VIH aux antirétroviraux au Tchad »?

Tenant compte des conditions dérisoires de nos laboratoires et du manque d’une main d’œuvre qualifiée, la meilleure stratégie pour une surveillance épidémiologique fiable serait de développer de nouvelles alternatives permettant la mesure de la charge virale et la détection des mutations de résistance ponctuelles sur papier buvard et sur plasma, avec des techniques efficaces et moins onéreuses, d’où l’intérêt de notre étude. C’est la raison pour laquelle, la technique du papier buvard, dénommée DBS (Dried Blood Spot) ou DPS (Dried Plasma Spot) parait la mieux indiquée pour élargir la surveillance virologique au traitement anti-VIH au Tchad.

La technique consiste à collecter du sang total (DBS) ou du plasma (DPS) sur un papier filtre appelé buvard. Cette technique se révèle être très pratique ne nécessitant pas forcément un personnel qualifié. Elle a démontré ses preuves dans les enquêtes séro- épidémiologiques car elle a pour avantage d’être facile à réaliser. Le DBS est acheminé vers les laboratoires pour les analyses moléculaires sous forme de courrier. La conservation ne nécessite pas une chaine de froid continue car il se conserve à température ambiante (Bertagnolio et al., 2010; Fiscus et al., 1998; Leelawiwat et al., 2009; Mee et al., 2008). Il faut noter cependant que récemment, plusieurs études réalisées en Amérique du Nord, en Europe et même en Afrique (Cameroun, Malawi, Tanzanie etc.) ont montré la faisabilité et la fiabilité de l’utilisation du DBS pour le contrôle de la charge virale et les mutations de résistance aux antirétroviraux (Adawaye et al., 2013; Bertagnolio et al., 2010; Johannessen et al., 2009). L’amplification pour la mesure de la charge virale à 1000 copies/ml et l’identification des mutations associées à la résistance sur DBS étaient similaires à celles déterminées sur le plasma (Arredondo et al., 2012). Une revue à la fin de ce chapitre nous renseigne plus sur les avantages du DBS dans le monitoring biologique dans les PRL.

Nonobstant, les tests génotypiques de résistance sur buvard ou sur plasma se révèlent

eux aussi être très onéreux et nécessitent des laboratoires équipés de type « Référence » et du

personnel qualifié. Les tests génotypiques standard quant à eux ne détectent une mutation de

résistance dans un échantillon que quand sa proportion dans l’échantillon atteint 20 % (Brun-

Vézinet et al., 2004; Halvas et al., 2006; Kuritzkes et al., 2003). C’est pourquoi, l’évaluation

et la mise en place au Tchad d’une technique basée sur la détection des mutations de

résistances ciblées (ASPCR pour Allele-Specific PCR) ainsi que la détection des mutations de

Chapitre I : Introduction Générale

résistance sur DBS seraient une panacée pour répondre aux besoins croissants des cliniciens dans leur prise de décision. L’ASPCR permet la détection des mutations mineures mêmes si elles sont présentes à faibles proportions ou celle de plusieurs mutations dans un même échantillon. Il est question pour nous ici, de rechercher les mutations de résistance sélectionnées essentiellement pour les médicaments utilisés au Tchad et qui en elles mêmes, confèrent une résistance majeure à l’exemple de la K103N ou la Y181C pour les INNTI et la M184V ou la T215F/Y pour les INTI. La barrière génétique étant faible pour ce groupe de médicaments (NVP et EFZ), une seule mutation pourrait entrainer une résistance irréversible (loi de tout ou rien).

Dans ce document, nous allons tout d’abord, donner un aperçu général sur les techniques utilisées pour la prise en charge des personnes vivant avec le VIH, en évaluant la faisabilité de chaque technique de prélèvement et de conservation de l’échantillon, de mesure de la charge virale et du génotypage. La technique ASPCR sera utilisée pour la détection des mutations ponctuelles. Nous allons enfin dégager les avantages et les limites de chaque technique qui sera par la suite transposable au Tchad.

Intérêt de l’étude

Etant donné que les tests de résistance n’étaient jusqu’à présent pas disponibles au

Tchad, ce travail apporte une connaissance approfondie sur la diversité génétique et l’enjeu de

la résistance dans la surveillance épidémiologique. Les recommandations tirées de cette étude,

permettrons l’implantation à court ou à moyen terme au Tchad des techniques de biologie

moléculaire testées et validées au laboratoire de Référence Sida de Liège durant notre

formation. La biologie moléculaire au Tchad est à l’état embryonnaire et ne se limite qu’à la

charge virale sur Abbott RealTime. La création d’un Centre de Référence Sida au Tchad serait

à notre avis un cadre idéal pour promouvoir cette discipline à l’échelle nationale et permettre

aussi aux cliniciens le choix des méthodes alternatives de prise en charge. Ceci leur permettra

de prendre des décisions rapides et efficaces pour donner de grandes chances aux malades de

vivre une vie longue, saine et quasi normale.

Chapitre I : Introduction Générale

II. Généralités sur le VIH et le Sida

2.1 Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH)

Le VIH appartient à l’ordre des Rétroïdes, à la grande famille des Rétroviridae, lesquels se caractérisent par leur génome d’ARN, qui est rétrotranscrit en ADN proviral à l’aide de la Transcriptase Inverse (TI) appelée encore Reverse Transcriptase (RT). Cette enzyme qui n’est pas pourvue d’activité correctrice comme l’ADN polymérase cellulaire laissera sur son passage, au cours de la rétrotranscription, de nombreuses erreurs à l’origine du fort taux de mutations présentes dans l’ADN rétroviral. Ce dernier, nanti désormais de la possibilité de pouvoir échapper à tout contrôle du système de défense de l’hôte et aux thérapies, s’intégrera dans le génome de la cellule hôte, restera en forme latente ou se reproduira pendant toute la durée de vie des cellules infectées. Il appartient au genre des lentivirus.

Suivant la structure de leur génome et le type d’infection dont ils sont la cause (lytique ou oncogène), les Rétrovirus se subdivisent en trois sous-familles: les lentivirus (parmi lesquels le VIH-1 et VIH-2), les oncovirinae et les spumavirinae.

Les lentivirus sont exogènes, non oncogènes et infectent principalement les cellules du système immunitaire (macrophages et lymphocytes T CD4

) ce qui explique le fait que les infections lentiformes résistent aux assauts du système immunitaire et causent généralement des immunodéficiences.

2.2 La diversité génétique des groupes et sous-types du VIH

A ce jour, ont été identifiés deux types de VIH, le VIH-1 (en 1983) et le VIH-2 (1986) qui se différencient sur la base de leur origine géographique, de l’organisation de leur génome et de leur lien de parenté avec le SIV (Simian Immunodefisciency Virus). L’origine de la diversité génétique s’explique par l’action de l’enzyme Reverse transcriptase qui est dépourvue d’activité 3’-5’ exanucléasique et qui est dépourvue d’activité correctrice comme l’ADN polymérase cellulaire. Elle laissera sur son passage, au cours de la retro transcription, un taux d’erreur très élevé de l’ordre de 10

à 10

; ce qui correspond à une à deux mutation(s) par cycle de réplication.

Le VIH-1 est classé depuis 1998 selon les critères phylogénétiques en quatre groupes,

dont chacun correspondrait à des transmissions indépendantes de SIV à l’Homme (Gao et al.,

Chapitre I : Introduction Générale 1999). Le plus répandu à travers le monde est le groupe M qui se subdivise en 9 sous-types ou clades (A, B, C, D, F, G, H, J et K), obtenus sur l’analyse génomique des gènes env et gag. La majorité des sous-types du VIH-1, responsable de la pandémie du VIH/SIDA, appartiennent à la lignée du VIH-1 du groupe M (Doualla-bell et al., 2010). Le groupe O (pour outlier group), présent en Afrique Centrale; le groupe N (pour non-M, non-O group) présent au Cameroun et un nouveau groupe putatif désigné P a été retrouvé chez deux patients camerounais (Lihana et al., 2012). Ce même groupe P a déjà été identifié chez une patiente camerounaise vivant en France (Plantier et al., 2009).

Les sous-types B correspondent au VIH que l’on soupçonne d’être à l’origine de l’épidémie dans les pays industrialisés (Amérique, en Europe et en Australie). Les sous-types non-B (qui regroupent tous les autres sous-types) seraient proportionnellement en augmentation. Parmi les sous-types non-B, les sous-types A, C, D et E se retrouvent largement en Afrique. Les sous-groupes N et O principalement présents au Cameroun demeurent plus rares (Bodelle et al., 2004).

La diversité génétique du VIH-1 augmente dans le monde. La majorité des cas est du aux virus VIH-1 de sous-types non-B, le sous-type B étant majoritaire uniquement sur le continent américain, en Europe de l’Ouest et en Australie. Ainsi, ce sont les VIH-1 de sous- type C qui sont responsables de plus de 50 % des infections dans le monde. Ceux-ci prédominent en Afrique du Sud, alors que les sous-types A et D sont présents en Afrique de l’Est (Peeters, Chaix, & Delaporte, 2008). Les sous-types de virus circulants en Afrique Centrale et responsables d'environ 85 % des nouvelles infections sont A (A1, A2, A3, A4, A5), C, CRF02_AG et D (Lihana et al., 2012). Certains sous-types se recombinent entre eux pour donner des virus recombinants, les CRF, composant de véritables mosaïques des différents sous-types. La prévalence des sous-types non-B est croissante, y compris en Europe, passant de 17 % en 1996-1999 à 28 % en 2000-2003 (S. Matheron et al., 2010).

En Europe et notamment en France, hormis le sous-type B, de nombreux autres sous-

types ou CRF non-B comme les virus A, C, D, F, G, H, CRF01_AE et aussi CRF02_AG y

circulent. La moitié des virus non-B isolés en France sont des virus CRF02_AG, ce qui

témoigne des liens existants entre la France et l’Afrique de l’Ouest (Peeters et al., 2008). Il

faut noter cependant que l’évolution de la maladie ne semble pas différente chez les patients

infectés par le CRF02_AG et ceux infectés par d’autres sous-types non-B (Atlas et al., 2005).

Chapitre I : Introduction Générale

Le type de VIH circulant au Tchad depuis l’avènement du SIDA est le VIH-1. Parmi les groupes circulants, seul le M avec les 4 sous-types (A, D, F et G) et trois recombinants (CRF01-AE, CRF02-AG et CRF11-cpx) sont majoritairement retrouvés. Le groupe O est minoritaire et le N n’est pas encore rencontré. Le VIH-2 lui aussi n’a pas encore été rencontré au Tchad (Vidal et al., 2003).

Le VIH-2 isolé en 1986 trouve son origine chez le singe Cercocebus torquatus et il est principalement retrouvé en Afrique de l’Ouest. Il faut y ajouter la prolifération et la circulation de nombreuses formes recombinantes qui sont sources de résistance croisée aux antirétroviraux. Pour le VIH-2, au moins huit transmissions inter-espèces de SIVsmm (Simian immunodeficiency virus from sooty mangabey monkeys) ont eu lieu entre l’homme et le mangabey enfumé, ce qui a conduit à définir 8 groupes de VIH-2 (A, B, C, D, E, F, G, H).

Les groupes A et B sont les plus représentés (Yeni, 2010).

2.3 La situation du VIH/SIDA au Tchad

Pays enclavé de l’Afrique Centrale d’une superficie de 1 284 000 km

, le Tchad est limité au Nord par la Libye, au Sud par la République Centrafricaine, à l’Est par le Soudan et le Soudan du Sud et à l’Ouest par le Niger, le Nigeria et le Cameroun. Cet enclavement extérieur est aggravé par une insuffisance des réseaux routiers qui rendent difficile l’évacuation des malades durant la saison des pluies car plusieurs formations sanitaires sont inaccessibles.

La population du Tchad est estimée en 2009 à 11 274 106 habitants avec un taux d’accroissement annuel de 3,6 %; ce qui permet d’estimer la population du pays à 12 100 453 habitants en 2011(CNLS, 2012; INSEED, 2009). La population féminine représente 50,7 % de la population totale contre 49,3 % pour les hommes. Les jeunes de moins de 18 ans représentent 57% du total. Près de la moitié (47 %) de la population total du pays est concentrée sur seulement 10 % de la superficie nationale, dans le Sud du pays. Près de 78,3 % de cette population vit en milieu rural, le reste vit dans la capitale N’Djaména et dans quelques grandes villes (Abéché, Moundou, Sarh, Bongor, Doba). La population nomade est estimée à 3,5 %.

Le Tchad est une mosaïque ethnolinguistique constituée de plus de 250 groupes

différents. Les deux langues officielles sont le Français et l’Arabe. Depuis 2003, le Tchad est

devenu un pays exportateur de pétrole. Le Gouvernement a identifié un certain nombre de

Chapitre I : Introduction Générale secteurs définis comme prioritaires dont ceux de la santé et de l’éducation, pour bénéficier d’une partie de ces ressources additionnelles, particulièrement en termes d’infrastructures à construire. Selon l’OMS, sur le plan économique, le Tchad reste encore un pays très pauvre malgré l’exploitation de son bassin pétrolier de Doba au sud du pays. En 2006, le pays occupait le 171

rang sur 177 pays du classement mondial et 55 % de sa population vit en dessous du seuil de la pauvreté (OMS, 2009). Son système de santé est peu performant dû essentiellement à l’insuffisance des ressources humaines qualifiées, des infrastructures sanitaires et des équipements médicaux.

L’épidémie du VIH au Tchad est de type évolutif et généralisé qui pourrait être en légère baisse ces dernières années, selon les dernières estimations de l’ONUSIDA (Onusida, 2013). Il est à noter que des pics de séroprévalence sont observés à Ndjamena, la capitale du Tchad (8,3 %) et au Logone Oriental (9,8 %). Il existe en plus, une disparité entre le milieu urbain (7 %) et le milieu rural (2,3 %). En fonction des tranches d’âges, la plus touchée pour le sexe masculin (3,5 %) est la tranche d’âge de 25 à 29 ans ; pour le sexe féminin (5,6 %) celles les plus concernées sont celles de 25 à 29 ans et celles de 30 à 34 ans. La tendance évolutive de cette pandémie s’explique par la persistance des conflits armés et des comportements sexuels à risque favorisés par les pesanteurs socio culturelles, l’analphabétisme et la pauvreté. Malgré l’absence des résultats d’une enquête récente sur le sujet, la première datant de 2005 donne une prévalence de 3,3 % chez les adultes de 15 à 49 ans dont 4 % chez les femmes et 2,6 % chez les hommes, avec des grandes disparités sous régionales (Onusida, 2013; Ouagadjio et al., 2005). Ce même rapport stipule que les estimations de l’ONUSIDA pour 2012 notifient que 210000 (180000-270000) personnes de tous âges vivent avec le VIH au Tchad ; il semblerait aussi que 16000 (12000-21000) nouvelles infections à VIH se produisent au Tchad (CNLS, 2012).

La Sérosurveillance sentinelle auprès des femmes enceintes lors de la consultation prénatale organisée en 2010 dans 13 sites a montré une séroprévalence de 3,4 % (CNLS, 2012). Cette prévalence est plus élevée dans certains sites, comme ceux des régions du Lac et de Logone occidental qui se chiffrent respectivement à 4,8 % vs 6,1 %. En termes de couverture de centre de PTME, le Tchad est passé de 107 sites en 2010 à 140 sites en 2011.

Le nombre des femmes enceintes ayant bénéficié de la prophylaxie contre le VIH est passé de

834 en 2010 à 1611 en 2011. En 2012, 1680 femmes enceintes vivant avec le VIH ont reçu

des ARV pour la PTME (CNLS, 2012). Malgré tous ces efforts fournis, la PTME demeure un

maillon faible.

Chapitre I : Introduction Générale

S’agissant de la couverture pour les ARV, l’ONUSIDA estime qu’en 2012, 35 014 adultes recevaient des ARV, soit environ 43% (38-51%) des patients qui en auraient besoin, puisque selon les recommandations de l’OMS de 2010, environ 82000 personnes (73000- 98000) devraient en bénéficier (Onusida, 2013). Les décès dus au sida en 2012 ont été estimés à 14000 cas (12000-19000). Entre 2011 et 2015, le nombre moyen annuel de personnes vivant avec le VIH dont l’état de santé nécessitera un traitement par les ARV est estimé à 105 071 personnes ; les besoins actuellement couverts sont d’environ 4 % (CNLS, 2012).

Par ailleurs, une enquête socio comportementale et de séroprévalence sous régionale menée en 2011 par le Projet d’Initiative du Bassin du Lac Tchad (PAIBLT) dans 4 régions du Sud du pays appartenant au basin conventionnel du lac Tchad, a révélé une prévalence de 5,5

% dans la population générale. Ces régions sont caractérisées par une grande mobilité des populations pour des raisons économiques. Cette prévalence relativement élevée tiendrait au fait que l’échantillonnage utilisé est constitué en grande partie des groupes à risque d’infection à VIH et n’a concerné que 4 régions sur les 22 que compte le pays.

Les données sur la situation au Tchad étant obsolètes, une Enquête Démographique de Sérosurveillance (EDS) est prévue en 2014 mais n’a pas encore vu le jour.

2.4 Le monitoring biologique pour la prise en charge de l’infection à VIH 2.4.1 Evaluation des signes cliniques

La classification en stades cliniques est prévue pour les patients dont l’infection par le VIH est confirmée par un test anticorps. Elle doit faire partie de l’évaluation initiale réalisée au cours de la première visite à l’entrée d’un programme de prise en charge et de traitement.

Dans les pays à ressources limitées, l’OMS recommande que le suivi biologique soit réalisé par la mesure des lymphocytes TCD4 et par l’évaluation des signes cliniques. Si la numération des TCD4 n’est pas disponible, l’évaluation des signes cliniques doit être utilisée pour guider les décisions quant à la mise sous prophylaxie par le Cotrimoxazole, à la mise sous TAR ou au changement de TAR. Le traitement antirétroviral améliore l’état clinique et contribue à un retour en arrière du stade clinique chez les patients ayant une maladie symptomatique.

Toutefois, pour suivre l’efficacité du TAR, pour définir un échec thérapeutique ou

pour pointer la nécessité d’un changement de traitement, la validité de l’utilisation du stade

clinique est moins bien connue. Il est urgent que des études déterminent la pertinence des

Chapitre I : Introduction Générale

critères cliniques (stade clinique sous traitement) afin de décider du moment opportun et de changer le traitement en l’absence des tests de numération des CD4 et de la charge virale (OMS, 2006).

Ces différentes phases de la maladie sont classées selon l’OMS en quatre stades (1, 2, 3 et 4) et selon la CDC en trois catégories (A, B et C).

Tableau 1 Classification de la maladie à VIH/ stades cliniques OMS

Classification de la maladie Stades Cliniques OMS

Asymptomatique 1

Modérée 2

Avancée 3

Sévère 4

2.4.2 Mesure des lymphocytes CD4

Le nombre de CD4 demeure le meilleur facteur pour prédire la survenue de complications liées au VIH même après avoir commencé le traitement (Gadelha et al., 2002).

Le seul paramètre immunologique pertinent pour surveiller et prendre en charge les patients infectés par le VIH est le nombre absolu de lymphocytes TCD4 circulants dans le sang.

Cependant, pour les distinguer des autres lymphocytes, on pratique un immuno-marquage avec des anticorps anti-CD4 fluorescents et on compte les cellules marquées par cytométrie de flux (une technique de numération automatique).

Valeurs normales des TCD4 : entre 600 et 1200/mm

Il existe normalement en règle générale 1500 à 4000 lymphocytes/mm

dont 70 % de lymphocytes T parmi lesquels 60 % de TCD4 et 40 % de TCD8. Ainsi, le taux de TCD4 est normalement supérieur à 600/mm

Le taux de lymphocytes TCD4. Ce taux peut varier d'une mesure à l'autre en raison de la variabilité du nombre de lymphocytes circulants.

Définition de l’échec virologique

Les définitions à la fois acceptables et fonctionnelles de l’échec immunologique sont

les suivantes: si le nombre de CD4 est inférieur à 100 cellules/mm

après six mois de

Chapitre I : Introduction Générale

traitement; ou encore s’il y a un retour au niveau des CD4 précédant le début du traitement (ou chute en dessous de ce niveau) après six mois de traitement; ou si s’il y a chute du nombre de CD4 à moins de 50 % de la valeur du pic obtenue sous traitement (lorsque cette valeur est connue).

Le nombre de CD4 peut également permettre de déterminer quand il ne faut pas changer de traitement (exemple: le cas d’un patient qui présente une nouvelle pathologie définissant un stade 3 en raison de laquelle on envisage de changer de traitement, ou le cas d’un patient asymptomatique dans le cadre de son suivi de routine habituel). Selon les recommandations de l’OMS datant de 2006, il ne devrait pas être recommandé de changer de traitement si le nombre de CD4 est supérieur à 200 cellules/mm

(OMS, 2006). Les nouvelles recommandations de l’OMS de 2013 encouragent par contre tous les pays à mettre en route le TAR chez les adultes vivant avec le VIH quand leur système immunitaire est encore fort;

c’est à dire dès que le nombre des LTCD4 devient inférieur à 500cellules/mm

ou moins. Les précédentes recommandations de l’OMS, formulées en 2010, incitaient à proposer le traitement au stade de 350 cellules CD4/mm

ou moins. Plusieurs pays (90%) avaient adopté les recommandations de 2010. Certains pays comme l’Algérie, l’Argentine et le Brésil, proposaient déjà le TAR au seuil de 500 cellules CD4/mm

(OMS, 2013).

2.4.3 Mesure de la charge virale

La mesure de la concentration plasmatique de l'ARN du VIH (ou charge virale) évalue l'intensité de la réplication du virus dans l'organisme qui se situe en fait non dans le sang mais bien dans les organes lymphoïdes. Le niveau de réplication du virus, estimé par la charge virale, est le paramètre le plus précis et le plus précoce pour prédire l'évolution clinique ultérieure. L'ARN viral est évalué par une technique d'amplification génique, la technique de polymérisation en chaîne PCR.

Compte tenu des variations de sensibilité des tests utilisés, il est important qu'un

patient soit suivi dans un même laboratoire avec la même technique. Les résultats sont

présentés à la fois sous la forme de la charge virale proprement dite (nombre de molécules

d'ARN viral ou copies par ml de plasma) et sous sa transformation logarithmique (log10 du

nombre de copies/ml). Toutefois, l'incertitude sur la mesure de la charge virale est élevée. On

considère que seule une variation de 0,5 log10 copies/ml est significative. Ce qui équivaut à

Chapitre I : Introduction Générale

un nombre de copies multiplié ou divisé par 3. Ainsi, une charge virale qui passe de 10 000 à 50 000 copies/ml correspond à une réelle augmentation, alors que le passage de 100 000 à 200 000 copies/ml n'est pas significatif.

La variabilité de la mesure est liée à deux phénomènes intriqués. Le premier phénomène est technique: Il fait référence à la variabilité des conditions de mesure au laboratoire. Le deuxième porte sur la fluctuation de la quantité de virus présents dans le plasma qui cause souvent des résultats faux positifs appelés « blips ».

Les principales méthodes de mesure de la charge virale sont résumés dans le tableau ci dessous (Hocini & Andreoletti, 2009; Serge et al., 2009).

Tableau 2 Comparaison des différentes techniques de mesure de la charge virale

2.4.4 Tests de résistance: le phénotypage (antivirogramme) et le génotypage

De nos jours, deux méthodes sont employées pour évaluer la résistance du VIH aux

différents médicaments: les tests phénotypiques et génotypiques. Les premiers reposent sur la

détermination de la concentration de produit actif nécessaire pour inhiber la réplication virale

de 50 % ou 90 %. S’agissant de la résistance phénotypique, elle est mesurée en comparant la

valeur de la concentration inhibitrice (CI) des isolats viraux testés à celle d’isolats de souche

sauvage. Une valeur élevée de la CI reflète cependant une perte de sensibilité du virus vis-à-

vis de tel ou tel agent antirétroviral (Larder B.A., 2000).