Détections des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

La technique ASPCR ou encore ARMS-PCR est utilisée pour détecter le polymorphisme bi-allélique. Son principe est issu de certaines propriétés observées dans l’étude des duplex amorce/ADN cible lors d’une réaction de PCR réalisée avec une ADN polymérase dépourvue d’activité 3’-5’ exonucléasique, ou activité Proof reading free. Parmi ces propriétés, deux sont importantes: Premièrement, la présence d’un mésappariement au niveau du duplex amorce/ADN cible surtout en 3’ de l’amorce ralenti considérablement l’extension de ce dernier par rapport à un duplex sans mésappariement et deuxièmement la présence d’un mésappariement en 3’ de l’amorce déstabilise considérablement le duplex.

En pratique, quand une mutation est connue, il est possible de dessiner une amorce qui sera spécifique à la mutation. La technique elle-même repose sur l’utilisation des trois amorces: deux amorces A1 et A2 complémentaires chacune d’un des deux allèles étudiés (l’allèle normal et l’allèle muté) et une troisième antisens (reverse) A3 commune aux deux allèles. La réaction de PCR est réalisée dans deux types différents:

 dans le premier tube, PCR avec l’amorce A1 spécifique à l’allèle normal et l’amorce A3 commune aux deux allèles (normal et muté) ;

 dans le deuxième tube, PCR avec l’amorce A2 spécifique à l’allèle muté et l’allèle A3 commune aux deux allèles (normal et muté).

Après amplification, la détection de la mutation, par exemple A/C, peut se faire sur gel d’agarose ou électrophorèse capillaire. Si le sujet est hétérozygote pour la mutation étudiée (génotype A/C), la réaction PCR sera positive dans les deux tubes (tube A1-A3 puis tube A2-A3. Si le sujet est homozygote sauvage (génotype A/A), la réaction de PCR ne sera positive que dans le tube 1 contenant l’amorce A1 non mutée et l’amorce A3. Chez un sujet homozygote muté (génotype (C/C), la réaction de PCR sera positive uniquement dans le tube 2 contenant A2 et A3 (Ameziane, Bogard, & Lamoril, 2005).

Procédure de la Reverse transcription, de l’Outer RT-PCR et de la PCR Spécifique L’ARN est extrait avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit à partir de 140 l de plasma centrifugé à 14 000 rpm, à 4°C pendant 90 min. L’éluât final est de 60 l. Des aliquotes de10 l sont réalisés et conservés à -70°C.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

Les produits utilisés

Hexanucléotide Mix, (10X concentré) /Random hexamers: Roche: Réf 11 277 081 001. dNTP: Roche diagnostic : 1127704901. SuperScript II Transcriptase 10,000U:

Invitrogen: 18064-014. Rnasin Ribonuclease Inhibitor 10 000U: Promega: N2515.

LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I: (Roche, Mannheim, Germany):

03515885001. Ultra Pure. 1M Tris-HCL: Life Technologie: 15568-025.

Tableau 3 Préparation du MMix 1: Annealing

Produits Pour 1 réaction Pour 10 réactions

Eau 8 l 80 l

Random Hexamer 10X 2 l 20 l

10 l d’extrait RNA sont ajoutés à 10 l de MMix pour un volume final de 20 l

Thermocycler 9 700: Annealing primer à 70°C pendant 10 min; 25°C pendant 10 min et conservé à 4°C à l’infini.

Tableau 4 Préparation du Master Mix 2: Enzyme Mix

Produits Pour 1 réaction Pour 10 réactions

5X first Straind Buffer 8 l 80 l

Dans le Cycler 9700 déjà programmé, 20l de Master Mix2 sont ajoutés à chaque tube de la 1^ère réaction puis le run est lancé. Le volume final est de 40l. Les conditions de cycling sont: 25°C pendant 10 min, 37°C pendant 45 min, 42°C pendant 45 min, 70°C pendant 15 min puis 4°C à l’infini. Le dNTPs, le 5Xfirst Straind Buffer utilisés sont les produits du Kit SuperScript II.

A la fin du run, on obtient un ADNc sur lequel on a pu faire toute la suite de l’analyse pour la détection des mutations de résistance. Puisqu’il n’est pas dilué, il est conseillé de ne prendre que 2 l pour la réalisation de la PCR (Outer PCR).

Chapitre II : Matériel et Méthodes

Première PCR ou Outer PCR

Elle est réalisée avec le Kit LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I.

En général, ce kit est utilisé pour amplifier des régions ne dépassant pas 900 bp. Il donne des résultats concluants pour amplifier une région de moins de 700 bp. Dans notre cas, nous avons amplifié une région de Pol contenant 644 bp (FOR = 2613-2635 et REV = 3234-3256 HXB2).

Préparation du MMix

 Dégeler le tube 1b avec capuchon vert de la « Reaction Mix » ;

 Centrifuger brièvement le tube 1a capuchon blanc contenant l’enzyme ;

 Garder les deux tubes dans un portoir réfrigéré ;

 Prendre 14 l de l’enzyme (1a) et le mettre dans le tube 1b de la « Reaction Mix » ;

 Chaque tube d’enzyme contient un volume suffisant pour 3 réactions Mix avec les tubes 1b ;

 Mélanger par refoulement mais sans trop agiter ;

 Ré-étiqueter le tube 1b réaction mix avec les étiquettes disponibles dans le kit « Master Mix 5x conc ». Une fois le Master Mix préparé, il se conserve entre -15 et - 25°C pour maximum 3 mois ou entre + 2 et + 8°C pour une semaine ;

 Le Mix est composé d’un milieu réactionnel qui contient l’enzyme. Pas besoin d’ajouter encore du MgCl2 ou autres réactifs ;

 Le volume final de 20 l doit contenir 2 l du ADNc puisqu’il est non purifié et 0,75 M de chaque primer (Outer Forward et Outer Reverse) ;

 La réaction est faite sur le thermocycleur 9 700 d’Applied Biosystems. Les conditions de cycling: le mélange est d’abord incubé 10 min à 95°C, puis 10 min à 94°C (dénaturation) puis 50 cycles d’amplification (15 sec à 94°C ; 20 sec à 62°C et 1 min à 72°C) et 72°C pendant 7 minutes puis 4°C à plus infini ;

Une analyse des points de fusion des produits de PCR de 60 ° C à 95 ° C a été effectuée afin de s'assurer de la spécificité des produits amplifiés, et seulement ceux des échantillons ayant une température prévue de 78 ° C ont été analysés par ASPCR.

Le produit de l’Outer PCR est dilué: 1/200 dans du 5 mM de Tris HCl Buffer à PH = 8. La solution mère du Tris HCl est à 1 M. Pour obtenir une solution à 5 mM, on prend 50 l du Tris HCl à 1 M que l’on met dans 9 950 l d’eau. Pour obtenir un produit PCR dilué à 1/200, on prend 5 l du produit PCR que l’on met dans 995 l d’eau.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

Tableau 5 Preparation du premier Master Mix pour ASPCR

Produits Pour 1 réaction Pour 10 réactions

Water, PCR Grade (Vial 2, colorless Cap) 12,5 l 125 l

l de MMix contenus dans la plaque. Le volume final pour la réaction est de 20 l.

Deux réactions par mutation sont réalisées séparément : une pour l’allèle normal et l’autre pour l’allèle muté: 2 l du produit de l’Outer PCR (dilué au 1/200) et chaque primer à 0,5 l sont utilisés avec le LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I pour un volume final de 20 l.

La détection des mutations ponctuelles se fait dans deux tubes différents pour chaque mutation. L’un pour le virus sauvage (allèle normal et allèle commun) et l’autre pour l’allèle muté (allèle commun et allèle muté). Les conditions de température diffèrent d’une mutation à une autre (Hauser et al., 2009, 2012).

 Pour K103N (AAC/AAT): Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 62°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

 Pour Y181C: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 60°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

 Pour M184V: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 56°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

 Pour K70R: Dénaturation= 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 48°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

 Pour T215Y et T215F: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 56°C pendant 10 secondes et 72°C pendant 10 sec).

NB : Chaque run est réalisé en double et la moyenne arithmétique est utilisée pour l’interprétation. Chaque essai a été effectué avec un ensemble complet de contrôles d'ADN mutant et de type sauvage.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

Tableau 6 Préparation du second MMix pour ASPCR

Produits Pour 1 réaction Pour 10 réactions

Water, PCR Grade (Vial 2, colorless Cap) 13 l 130 l

Primer 1 Fwd (20 M) 0,5 l 5 l

Primer 2 Rev (20 M) 0,5 l 5 l

MMix, 5xconc 4 l 40 l

Total 18 l 180 l

Sur Eppendorf cooler, 18 l de MMix sont distribués dans une plaque 96 puits puis on a ajouté 2 l du produit de Outer PCR dilué dans le Tris HCl à 5mM, PH = 8. Le volume final pour la réaction est de 20 l. Sur LightCycler 480 (Roche), le run est lancé et dure environ 1h20mn. L’interprétation du résultat est détaillée dans la partie résultats de la détection des mutations ponctuelles.