Tests de résistance: le phénotypage (antivirogramme) et le génotypage

De nos jours, deux méthodes sont employées pour évaluer la résistance du VIH aux différents médicaments: les tests phénotypiques et génotypiques. Les premiers reposent sur la détermination de la concentration de produit actif nécessaire pour inhiber la réplication virale de 50 % ou 90 %. S’agissant de la résistance phénotypique, elle est mesurée en comparant la valeur de la concentration inhibitrice (CI) des isolats viraux testés à celle d’isolats de souche sauvage. Une valeur élevée de la CI reflète cependant une perte de sensibilité du virus vis-à-vis de tel ou tel agent antirétroviral (Larder B.A., 2000).

Chapitre I : Introduction Générale

Les tests génotypiques sont fondés sur l’analyse des séquences du gène de la Protéase et de la Reverse transcriptase. La résistance génotypique reflète la présence de mutations à donné. Dans le cas des mutations mineures, l’accumulation de plusieurs substitutions secondaires est nécessaire pour observer un phénotype de résistance élevé (Larder B.A., 2000).

Le Séquençage

Le séquençage de l’ADN a été inventé dans la deuxième moitié des années 1970.

Deux méthodes ont été développées indépendamment: l’une par l’équipe de Walter Gilbert, (Maxam and Gilbert 1977) aux États-Unis, et l’autre par celle de Frederick Sanger (Sanger, Nicklen et al. 1977) en Grande-Bretagne. Ces deux méthodes sont fondées sur des principes diamétralement opposés: l’approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980 (Kolata 1980). Par ailleurs, la première méthode non Sanger ayant fait ses preuves dans le domaine du séquençage a été introduite en 1988 (Hyman, 1988; Ronaghi, 2001). Il s’agit du pyroséquençage, une technique principalement basée sur l’addition d’un seul nucléotide qui est révélé en temps réel par détection de la luminescence.

Principe de la méthode de Sanger et Nicklen

Cette méthode se base sur l’interruption de la synthèse enzymatique d’un brin d’ADN complémentaire (arrêt d’élongation). L’ADN à séquencer est cloné et de nombreuses molécules d’ADN simple brin sont produites. Une courte amorce d’oligonucléotides (généralement synthétisée chimiquement et éventuellement marquée) est ajoutée à l’ADN. Le point de fixation de l’amorce sert de point de départ pour la synthèse du brin complémentaire (Lamoril et al., 2008).

Chapitre I : Introduction Générale

Comme pour la méthode précédente, les bandes sont révélées par autoradiographie et la séquence est lue directement sur le gel. Une adaptation de cette technique consiste à marquer les didéoxynucléotides plutôt que les amorces, ce qui permet de n’utiliser qu’un seul mélange au lieu des quatre nécessaires dans le cas d’un marquage des amorces. Chaque didésoxyribonucléotides est marqué par un fluorochrome spécifique. Les fragments d’ADN synthétisés portent ce fluorochrome terminal. On les appelle des terminateurs d’élongation ou des «BigDye Terminators» ou des «Dye-labeled terminator». Dans ce cas on parle d’un séquençage par arrêt de synthèse à l’aide d’un terminateur marqué « dye terminator sequencing» tel que proposé par Smith et al. (Smith, Sanders et al. 1986). C’est la technique actuellement utilisée dans certains séquenceurs automatisés.

Figure 1 Principe du séquençage selon la méthode de Sanger

Après dénaturation du produit amplifié par séquençage, l’un des deux brins s’hybride à une amorce spécifique. Le mélange réactionnel contient, outre les tampons et l’ADN polymérase, des déoxynucléotides triphosphates (dNTP, dA-, dC-, dG-, dT-TP), mais aussi des didéoxynucléotides triphosphates (ddNTP, ddA-, ddC-, ddG-, ddT-TP). L’incorporation aléatoire d’un ddNTP à la place d’un dNTP ne permet plus la polymérisation par l’ADN polymérase entrainant l’arrêt de l’extension.

À la fin de la réaction de séquence effectuée selon des cycles thermiques identiques à ceux de la PCR (on parle de PCR asymétrique, une seule amorce étant utilisée au lieu de deux), nous avons des fragments de taille différente. Ces fragments sont soumis à migration dans un champ électrique. Il s’agit le plus souvent d’une électrophorèse capillaire. Chaque ddNTP étant marqué par un fluorochrome différent, un signal lumineux sera généré, spécifique de la base didéoxy incorporée. Les fragments étant de taille différente et la résolution allant jusqu’à une base de différence, il sera simple de recueillir ce signal et en

Chapitre I : Introduction Générale déduire la séquence. Les signaux lumineux sont analysés par un logiciel spécifique, et le résultat de l’analyse peut être lu, par exemple, sous forme d’un électrophorégramme de lecture facile. Des logiciels d’interprétation des séquences sont également disponibles. Pour confirmer un résultat, toute réaction de séquence d’un fragment d’ADN est systématiquement faite sur le brin sens et le brin antisens.

Principe de la Méthode de Maxam & Gilbert (Maxam & Gilbert, 1977)

Cette technique est pratiquement abandonnée de nos jours. Nous la décrirons brièvement pour des raisons historiques. Cette méthode utilise des échantillons d’ADN double brin et ne nécessite donc pas le clonage de l’ADN dans un vecteur pour produire de l’ADN simple brin comme c’est le cas pour la méthode de Sanger. Cette méthode est basée sur une dégradation chimique de l’ADN et emploie les réactivités différentes issues des quatre bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives. En reconstituant l’ordre des coupures, on peut remonter à la séquence des nucléotides de l’ADN correspondant.

La méthode de Maxam et Gilbert nécessite des réactifs chimiques toxiques et reste limitée quant à la taille des fragments d’ADN qu’elle permet d’analyser (< 250 nucléotides).

Moins facile à robotiser, son usage est devenu aujourd’hui confidentiel.