Utilisant la cytométrie en flux : Luminex ® et Becton

Dickinson

Deux méthodes similaires utilisant des microparticules fonctionnalisées pour la capture de biomolécules ont été développées et commercialisées par Becton Dickinson® et Luminex®. Cela consiste à conférer une signature fluorescente unique à des microparticules en incorporant différents ratios de fluorophores dans leur masse. Les particules sont également fonctionnalisées, avec des biomolécules complémentaires de la molécule cible afin de capturer celle-ci. La présence de la molécule d’intérêt est révélée par une autre biomolécule complémentaire marquée par un fluorophore. Les molécules capturées ainsi

peuvent être des antigènes, de l’ADN, des protéines etc… (Figure 2-15 b). Les sandwichs sont ensuite analysés de manière individualisée par cytométrie en flux ou par un appareil optique similaire dans le cas de Luminex® (Figure 2-15 a). La mesure de plusieurs fluorescences simultanées par le cytomètre de flux permet de mesurer la présence de la cible et de la particule simultanément et donc de savoir quelle est la cible capturée. Avec cette technique il est possible de mesurer des quantités d’amplicon d’ADN de l’ordre de 0,1 femtomoles (6.103 copies d’ADN) en 45 min à 1 h et de détecter 100 molécules différentes dans un puits d’une plaque à 96 puits (Dunbar et al, 2003; Dunbar et al, 2006). Cette méthode est donc rapide mais nécessite quand même une amplification préalable de l’ADN par PCR ainsi qu’un équipement coûteux. Il peut toutefois s’agir d’une bonne alternative à la détection d’amplicons de PCR par électrophorèse car elle permet le multiplexage et d’atteindre un seuil de détection plus bas (6.103 copies d’ADN contre 4.106 copies d’ADN pour une PCR-SSP).

Figure 2-15 : a) Schéma de la détection par la technologie Luminex®. La particule est excitée simultanément par deux lasers, la fluorescence résultante permet de dire quelle est la cible grâce à la signature spectrale de

la particule et la fluorescence des biomolécules de détection met en évidence la présence de la cible [http://www.viracor.com]. B) Schéma des combinaisons possibles pour capturer différents types de

biomolécules [http://www.teomed.ch].

2.5.2 Utilisant

une

approche

par

biocode-barres :

Nanosphere

Nanosphere Inc est une entreprise américaine spécialisée dans le diagnostic moléculaire. Elle commercialise une puce nommée Verigene® permettant de réaliser différents types de diagnostic et dérivée de la méthode scanométrique couplé à l’utilisation de biocode-barres décrite par Chad Mirkin (section 2.3.1 aux paragraphes relatifs à la scanométrie et à la fluorescence).

Des particules magnétiques sont fonctionnalisées avec des oligonucléotides ou des anticorps complémentaires de la cible. Une autre particule est fonctionnalisée avec une biomolécule complémentaire de la cible et des Biocode-barres. En présence de la cible les particules forment un sandwich, les biocode-barres sont récupérés et sont hybridés sur une surface solide préalablement fonctionnalisée avec des sondes. Des sondes complémentaires liées à une particule d’or s’hybrident avec les biocode-barres présents à la surface de la puce. Les particules d’or sont révélées par un dépôt d’argent suivant un processus catalytique décrit précédemment.

Figure 2-16 : a) Schéma de la détection de protéine par le système Verigene®, b) schéma de la détection des biocode-barres sur la puce et c) photo de la puce dans lequel l’essai est réalisé (Issus de www.nanosphere.us)

L’échantillon et les réactifs sont introduits dans la puce et l’essai est réalisé en 1h30 à 3h30, dans un appareil spécifique (Processor SP®). La puce est constituée de différents compartiments et de canaux microfluidiques permettant la réalisation des différentes étapes du test à savoir l’extraction de l’ADN (par sonication) et sa capture. Pour l’étape de détection la puce doit être placée dans un autre appareil (Verigene reader®). Tout le test est automatisé ce qui réduit considérablement le temps de manipulation (Lefferts et al, 2010). Cet essai évite l’étape d’amplification par PCR et permet le multiplexage. Des puces ont été développées pour réaliser la détection de pathogènes (Jannetto et al, 2010), de protéines

(Buchan et al, 2011), et pour le génotypage (Lefferts et al, 2009; Lefferts et al, 2010). Il s’agit d’une bonne alternative à la PCR car elle permet d’obtenir des résultats comparables en moins de temps. Cependant, la méthode nécessite un échantillon d’ADN plus concentré que pour la PCR et la réalisation du test complet nécessite deux appareils ce qui augmente son coût.

Les performances des différents outils de diagnostic utilisant des micro et nanoparticules présentés dans cette section sont résumées dans le Tableau 2-8.

Tableau 2-8 : Différents outils de diagnostic in vitro utilisant les micro et nanoparticules commercialisés

Méthode Biomolécule recherchée V. éch. V. analyse. Tps analyse Tps de détection LOD (nb de copies détectées) Spécificité coût Réf PCR-SSP + gel d’électrophorèse ADN fragmenté et amplifié = amplicon 750 µL 10 µl 3h 1h30 4.10 6 +++ (SNP) +++ (Shyamala et al, 1989; Hurd et al, 2002), (Cavanagh et al, 1997) Luminex amplicons 17 µl 65 µl 18 min 35 min 1,5.106 + +++ (Dunbar et al, 2003)

Nanosphere ADN viral 200

µl 250 µl 1 min 3h30 / +++ (SNP) +++

(Jannetto et al, 2010) Nanosphere ADN humain 25 µl 50 µl 1 min 1h30 3.106 +++ (SNP) +++ (Lefferts et al, 2009)

Nanosphere ADN humain 1000

µl 1000 µl 1 min 3h30 / +++ (SNP) +++ (Buchan et al, 2011)

ELISA Protéine 750

µl 100 µl 3h 30 min 1.10

-11

+++ +++ (Butler, 2000) Luminex Anticorps 50 µl 100 µl 18 min 3h / / +++ (Dunbar et al, 2003)

Pour conclure, nous avons vu dans cet état de l’art que le marché des outils de diagnostic moléculaire in vitro utilisant les micro et nanoparticules est en expansion et beaucoup d’étude et de progrès sont réalisés dans ce domaine. Cet état de l’art n’est pas exhaustif mais il met l’accent sur ce qu’il est possible de faire dans ce domaine et sur les paramètres à prendre en compte pour la réalisation de tels outils de diagnostic comme les types de particules à utiliser et la méthode de détection à choisir. Cet état de l’art montre également que malgré les nombreux progrès fait dans ce domaine, l’outil de diagnostic idéal n’existe pas et que les résultats obtenus en termes de sensibilité et de spécificité dépendent grandement du type de particules utilisées, de la fonctionnalisation de surface réalisée pour capturer la molécule cible et pour amplifier le signal et de la méthode de détection choisie. L’ANNEXE A contient un tableau récapitulatif du type de particules à utiliser en fonction de la

méthode de détection choisie et des tableaux récapitulatifs des performances des différents tests décrits dans cet état de l’art. Au cours de la présentation du dispositif de détection d’ADN que nous allons décrire dans ce travail les différents paramètres à prendre en compte relevés ici seront discutés et étudiés.

La section suivante présente le modèle biologique servant de démonstrateur pour notre outil de capture d’ADN à savoir le génotypage plaquettaire. Après un descriptif des antigènes plaquettaires et de la manière de les détecter nous discuterons des enjeux de la réalisation d’un outil de diagnostic pour cette application, ainsi que des avantages de son développement.