Mesures de fluorescence des sandwichs obtenues avec l'Evareader

 Principe

L’Evareader permet de mesurer la fluorescence des particules se trouvant proches de la surface des EVA-chip. Les échantillons sont analysés selon le protocole décrit à l’ANNEXE D section D.6.3 après le processus complet de formation des sandwichs.

Les mesures sont réalisées pendant 900 secondes et les pentes des courbes de cinétique obtenues sont analysées entre 0 et 200 secondes.

 Résultats

 Impact de la présence de la cible et de la spécificité sur la cinétique de fluorescence L’Evareader permet d’obtenir en temps réel la cinétique de fluorescence des particules, ce qui correspond à la quantité de particules immobilisées au fond de l’EVA-chip en fonction du temps. Seules les particules fluorescentes émettent un signal quand elles sont excitées à 635 nm, celles-ci sont les seules à être fonctionnalisées avec des sondes biotinylées qui vont permettent l’immobilisation des particules au fond de l’EVA-chip par interaction neutravidine/biotine. Les cinétiques de fluorescence représentées sur la Figure 4-14 A correspondent donc à la cinétique d’immobilisation des particules fluorescentes au fond de l’EVA-Chip pour chaque échantillon. La cinétique de fluorescence est liée à la concentration en particules dans la solution et à l’affinité des particules au fond de l’EVA- chip. Dans notre cas, seule la concentration en particules varie et va influer sur la cinétique de fluorescence observée. Plus la concentration en particules dans l’échantillon est importante, plus la surface du puits de l’EVA-chip est saturée rapidement et plus la pente de la cinétique mesurée est importante.

Afin d’évaluer la présence des particules fluorescentes pour chaque échantillon, cette pente est analysée entre 0 et 200 secondes, comme cela est représenté sur la Figure 4-14 B dans le cas de la formation de sandwichs spécifiques (sonde a / cible a) et non spécifiques (sonde b / cible a). Le rapport entre les pentes est plus important entre 0 et 40 sec mais la pente est alors calculée sur seulement deux points ce qui n’est pas assez précis. Nous avons choisi d’analyser les pentes entre 0 et 200 sec de manière à prendre en compte plus de

points. La Figure 4-14 B montre que dans le cas où la cible et les sondes sont complémentaires (sonde a / cible a), la pente de cinétique de fluorescence mesurée est plus importante que celle observée dans le cas où il y a un mésappariement entre la cible et la sonde (sonde b / cible a). Cela traduit que plus de particules fluorescentes ont été capturées dans le cas de la formation des sandwichs spécifiques que dans le cas de la formation des sandwichs non spécifiques. L’analyse des pentes mesurées pour chaque échantillon (Figure 4-15) permet de comparer les valeurs de pente entre elles en fonction de la présence de la cible et de la spécificité du système.

A)

B)

Figure 4-14 : Mesure par l’Evareader de la cinétique de fluorescence des essais de formation des sandwichs [BMg-cible-BFg] ayant été réalisés dans le PBS 0,07X en présence de 2,5 µM de cible : A) Mesures de cinétique de fluorescence réalisées entre 0 et 900 sec B) Évaluation des pentes issues des cinétiques de

 Impact de la présence de la cible et de la spécificité sur les pentes issues de la cinétique de fluorescence

L’histogramme de la Figure 4-15 représente les valeurs de pentes mesurées entre 0 et 200 secondes pour chaque échantillon.

Les solutions d’ODN sont les témoins permettant de vérifier si la fonctionnalisation de la surface des puits par la neutravidine est correctement réalisée. Les ODN utilisés sont marqués avec un Cy5. La pente issue de la cinétique de fluorescence pour la solution contenant des ODN biotinylés est environ 20 fois plus importante que celle obtenue pour la solution contenant des ODN non biotinylés Figure 4-15 (a). Cela indique que les puits sont bien recouverts de neutravidine et que l’interaction neutravidine/biotine est bien effective.

Lorsque les particules sont fonctionnalisées avec des sondes a, les pentes observées pour les échantillons témoins (Figure 4-15 b et c) sont significativement inférieures à la pente observée lorsque les sandwichs sont formés (Figure 4-15 d). Lorsque les particules fluorescentes sont fonctionnalisées avec des sondes b (non complémentaires de la cible), la pente observée lorsque les sandwichs non spécifiques se forment (Figure 4-15 d rayé) n’est pas significativement différente des pentes observées pour les témoins (Figure 4-15 b et c rayé). La pente observée pour l’échantillon où la cible a été mise en présence de particules non fonctionnalisées est élevée (Figure 4-15 b rayé). Toutefois, l’écart type observé pour ce point est conséquent et laisse penser qu’il s’agit d’un point aberrant.

La pente observée lorsque la cible a est mise en présence des particules fonctionnalisées avec la sonde b (Figure 4-15 d rayé) est 2,6 inférieure à celle observée lorsque la cible a est mise en présence des particules fonctionnalisées avec la sonde a (Figure 4-15 d).

Figure 4-15 : Pentes moyennes résultant de la mesure de la cinétique de fluorescence à 635 nm entre 0 et 200 secondes. (a) Témoins ODN (sans particules et marqués avec un Cy5) : ODN sans biotine à une concentration de 0,1 µM qui constitue le témoin négatif puisqu’il n’est pas immobilisé au fond du puits ; et ODN avec biotine à une concentration de 0,1 µM qui constitue le témoin positif car il va venir s’immobiliser au fond du puits par interaction avec la neutravidine ; (b) Particules non fonctionnalisées mises en présence

de cible, (c) particules fonctionnalisées sans cible, et (d) sandwichs [BMg-cible-BFg] complet.

 Interprétation et discussion

Les résultats obtenus par analyse des échantillons à l’Evareader sont en accord avec ceux obtenus par scanner de fluorescence. Ils montrent qu’il y a peu d’adsorption non spécifique entre les particules. De plus, les résultats montrent que le test couplé à l’analyse par Evareader permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1. En effet, la réalisation d’une analyse de variance (ANOVA) montre que la pente résultant de la cinétique de fluorescence obtenue lors de la formation de sandwichs spécifiques est significativement différente et plus élevée (à 90%) que celle obtenue dans le cas où la cible a est mise en présence de particules fonctionnalisées avec la sonde b. Toutefois, la pente observée lors de la formation des sandwichs spécifiques n’est que 2,6 fois supérieure à celle observée lorsque les sandwichs non spécifiques sont formés. Cela est en accord avec ce que prédisent les simulations réalisées avec DINAMelt décrites à la section 3.3.2 au paragraphe relatif aux conditions d’hybridation. Cela montre que les conditions de formation des sandwichs ne sont pas encore suffisamment spécifiques.

L’analyse par Evareader semble être une méthode appropriée pour détecter en temps réel la présence de l’ADN cible. Cette méthode est rapide, ne nécessite pas trop de préparation. Toutefois, les conditions de spécificité de formation des sandwichs ne sont pas encore assez robustes pour que les résultats obtenus avec l’Evareader permettent de discriminer correctement la présence de la cible spécifique ou non. De plus, les résultats de pente obtenus ici sont bas (inférieurs à 1000 unités / secondes). Deux hypothèses peuvent expliquer cela :

1. Peu de particules fluorescentes ont été capturées lors de la formation des sandwichs du fait des faibles rendements de formation des sandwichs dans les conditions d’hybridation choisies. En effet, nous avons vu que seulement 3,5% de sandwichs spécifiques sont formés dans ces conditions (section 3.3.2 au paragraphe relatif aux conditions d’hybridation).

2. Le choix a été fait d’analyser les sandwichs complets afin de limiter les manipulations et de ne pas allonger le temps d’analyse. De ce fait, il est possible que la présence des particules magnétiques gène l’interaction neutravidine/biotine entre la surface de l’EVA-chip et les particules fluorescentes, ce qui peut fausser et abaisser le signal.

Cette analyse et les résultats obtenus avec l’Evareader sont à comparer avec les résultats obtenus avec les autres méthodes de détection de la fluorescence.

4.3.5 Mesures de fluorescence des sandwichs obtenues par