Différentes micro et nanoparticules utilisées pour le diagnostic moléculaire in vitro

Par leurs propriétés particulières, telles leur taille et leur rapport surface/volume élevé, les micro et nanoparticules sont des outils de choix pour développer des dispositifs miniaturisés. Grâce aux progrès réalisés dans la synthèse des particules, il est possible de créer des particules multifonctionnelles et facilement fonctionnalisables. Elles peuvent également être marquées avec un fluorophore ou posséder des propriétés multiples (particules magnétiques fluorescentes, particules thermosensibles). Un certain nombre de particules ont été développées mais quatre types, les particules magnétiques, les nanoparticules d'or, les quantum dots et les particules fonctionnalisées et multifonctionnelles sont plus particulièrement utilisées pour créer des outils de diagnostic in

vitro afin de détecter des agents pathogènes, faire du génotypage ou mettre en évidence la

présence d’un biomarqueur par exemple.

2.2.1 Nanoparticules d’or

Les nanoparticules d’or sont composées d’un cœur diélectrique entouré d’une fine couche d’or. Leur taille varie entre 0,8 et 250 nm (Azzazy et al, 2009). Leurs propriétés optiques et physiques font d’elles de bons outils de détection car elles favorisent l’absorption de la lumière et sa diffusion. Ces propriétés varient en fonction de la taille des particules, de leur forme et de la distance qui les sépare les unes des autres. Lorsque les particules se rapprochent à une distance de moins de 25 nm, leurs propriétés de diffusion et d’absorption de la lumière varient, et cela se traduit par un changement de couleur de la solution du rouge vers le bleu. Les nanoparticules d’or possèdent également des propriétés d’extinction de fluorescence (quenching). Du fait de ces propriétés, et parce qu’elles sont facilement synthétisables et fonctionnalisables, les nanoparticules d’or sont très utilisées comme éléments de détection pour le diagnostic moléculaire in vitro (Azzazy et al, 2012). Souvent elles sont couplées à une détection par fluorescence, à du SERS (Surface Enhanced Raman Scattering), à la SPR (Surface Plasmon Resonance) ou à la conductimétrie

(Jain, 2005). Elles peuvent également être utilisées comme élément de capture des biomolécules d’intérêt lorsqu’elles sont fonctionnalisées ou pour l’imagerie médicale (Saha

et al, 2012).

2.2.2 Quantum dots

Les quantum dots (QDs) sont des cristaux de semi-conducteurs ayant un diamètre de 2 à 10 nm (Azzazy et al, 2009; Valizadeh et al, 2012). Les QDs ont la capacité d’émettre une fluorescence importante quand ils sont excités par une lumière UV. Cette fluorescence est caractérisée par un large spectre d’excitation et un spectre d’émission étroit. Les QDs sont photostables, ils évitent le photoblanchiment et ont une bonne résistance à la dégradation. La fluorescence des QDs varie en fonction de leur taille et du semi-conducteur dont ils sont composés (Jain, 2005). Plus leur diamètre est important, plus la longueur d'onde émise est grande (vers le rouge) et inversement (Figure 2-3). En ce qui concerne les outils de diagnostic

in vitro, les QDs sont principalement utilisés comme marqueurs et éléments de détection.

Des tests utilisant les QDs comme détecteurs de biomarqueurs de cancer ou pour marquer des molécules comme des anticorps ou de l’ADN à des fins de détection de maladies infectieuses par exemple ont été décrits (Valizadeh et al, 2012). Les QDs ont toutefois le désavantage d’être cytotoxiques et peuvent s’oxyder au contact de l’eau ou de l’oxygène (Hurd et al, 2002; Azzazy et al, 2009), (Probst et al, 2012). Leur émission dépend également de leur environnement chimique et de leur fonctionnalisation qui peuvent entraîner un phénomène de clignotement des QDs.

Figure 2-3 : Illustration de la variation des spectres de fluorescence de QDs CdSe/ZnS en fonction de leur taille quand ils sont excités à 365 nm [www.elec-intro.com]

2.2.3 Particules magnétiques

Les particules magnétiques sont des micro ou des nanoparticules possédant un cœur ou une enveloppe de métal qui leur confère des propriétés magnétiques. Grâce à ces propriétés, elles peuvent être utilisées pour des applications médicales diverses comme en imagerie par résonance magnétique (IRM), pour la délivrance de médicaments, ou pour la thérapie en oncologie via l’hyperthermie (Shinkai et al, 2002). Pour le diagnostic in vitro, elles sont principalement utilisées pour réaliser des séparations, des purifications ou des concentrations d’échantillons après avoir été fonctionnalisées avec des biomolécules (anticorps, oligonucléotides…) complémentaires de la molécule à mettre en évidence (Shinkai et al, 2002; Haun et al, 2010; Frimpong et al, 2010). En effet, du fait de leur forte magnétisation, ces particules permettent de réaliser des séparations magnétiques rapides et simples grâce à un aimant. Cela permet d’éviter d’utiliser la centrifugation ou la filtration pour purifier ou laver des échantillons et de ce fait d’avoir moins de pertes ou de contraintes sur l’échantillon. De plus, elles sont stables, peu coûteuses, permettent la détection en milieu turbide et sont biocompatibles (Haun et al., 2010).

Les particules magnétiques peuvent également être utilisées comme outil de détection puisque leur agrégation entraîne des changements dans leur environnement magnétique. La mesure de ces changements permet de mettre en évidence la présence de la biomolécule recherchée comme cela sera expliqué plus tard.

2.2.4 Particules fonctionnalisées et multifonctionnelles

Il existe principalement trois méthodes pour ajouter une ou plusieurs fonction à une particule (magnétique, latex, or, QDs, etc...) : la fonctionnalisation de surface, l’enrobage dans un autre matériau ou l’incorporation d’un autre matériau dans la masse de la particule (particule cœur-coquille).

Les progrès en chimie de surface ont permis de fonctionnaliser facilement toutes sortes de particules (magnétiques, latex, or, QDs, etc...), in situ ou après synthèse, pour leur conférer des propriétés supplémentaires. Il est donc possible d’ajouter des groupements chimiques à la surface des particules afin de fixer des biomolécules telles que des protéines, des récepteurs, des antigènes, des anticorps ou des oligonucléotides. Ces particules biofonctionnalisées pourront servir d’outils de capture ou de marquage de la biomolécule cible pour sa détection.

Un autre moyen de conférer de nouvelles propriétés à des particules est de les enrober avec un matériau aux propriétés particulières et/ou avec une substance luminescente. Ainsi, certains polymères comme le poly(N-isopropylacrylamide) peuvent attribuer des propriétés thermo-dépendantes aux particules (Balasubramaniam et al, 2011). Ces particules multifonctionnelles sont de plus en plus utilisées pour élaborer des outils de diagnostic car elles ont des propriétés riches et modulables en fonction de paramètres simples tels que la température ou le pH.

L’incorporation d’un fluorophore ou d’un colorant à l’intérieur de la masse de la particule ou dans le polymère d’enrobage permet de rendre des particules luminescentes, ce qui leur confère également des propriétés intéressantes. L’incorporation du fluorophore dans la particule le protège du photoblanchiment et de la dégradation. Les particules rendues fluorescentes sont souvent à base de polymères comme le latex mais peuvent également avoir un cœur magnétique ou de silicium, ce qui en fait des particules multifonctionnelles. En effet, en enrobant des particules magnétiques avec un polymère marqué avec un fluorophore, les nouvelles particules auront à la fois des propriétés magnétiques et optiques. Des particules luminescentes diverses sont utilisées comme marqueurs pour détecter de manière directe ou indirecte les biomolécules d’intérêts lors d’un diagnostic in vitro.(Probst et al, 2012).

Comme nous venons de le voir, il existe plusieurs sortes de micro et nanoparticules pouvant être utilisées pour le diagnostic moléculaire in vitro et chacune d’elles a des propriétés particulières qui lui sont propres. Notons également l’apparition de nouvelles nanostructures comme les nanotubes qui sont utilisés pour réaliser des outils de diagnostic

in vitro. Il s’agit de petite structure avec un diamètre de quelques nanomètres et qui ont des

propriétés semi-conductrices (Wanekaya et al, 2006). Ils sont souvent utilisés pour réaliser des biocapteurs avec une détection électrique (Hahm et al, 2004; Wanekaya et al, 2006;

Chang et al, 2011). Ces structures et ces biocapteurs ne seront pas développés ici.

Nous allons maintenant décrire différentes méthodes de détection avec lesquelles ces particules peuvent être couplées pour réaliser des outils de diagnostic moléculaire. Nous allons particulièrement nous intéresser aux avantages et aux inconvénients de chacun.

2.3 Techniques de diagnostic moléculaire in vitro