Mesures de fluorescences des sandwichs obtenues avec le scanner de fluorescence

 Principe

Le scanner de fluorescence possède un laser à 532 nm et un laser à 635 nm, ce qui permet de mesurer la fluorescence des particules fluorescentes (excitées par le laser à 635 nm) et la fluorescence de la cible marquée avec un Cy3 (excité par le laser à 532 nm). Les échantillons sont analysés selon le protocole décrit à l’ANNEXE D section D.6.1 avant le début du test (Figure 4-12 A et Figure 4-13 A), après l’hybridation des particules magnétiques avec la cible (Figure 4-12 B et Figure 4-13 B) et après le processus complet de formation des sandwichs (Figure 4-12 C et Figure 4-13 C).

 Résultats

 Mise en évidence de la cible marquée Cy3

Les résultats des mesures de fluorescence réalisée à 532 nm montrent que les particules magnétiques ne présentent pas de fluorescence et n’interfèrent donc pas avec le signal de fluorescence de la cible (Figure 4-12 A).

Après l’étape d’hybridation de la cible sur les particules magnétiques et le retrait de l’excès de cibles (Figure 4-12 B), la fluorescence à 532 nm n’augmente pas significativement

lorsque la cible est en présence de particules non fonctionnalisées (Figure 4-12 B c), ce qui indique qu’elle n’est pas adsorbée sur les particules.

Après l’hybridation de la cible a avec les particules magnétiques fonctionnalisées, la fluorescence mesurée à 532 nm est 119 fois plus importante qu’avant l’hybridation, ce qui indique que la cible est hybridée avec les sondes greffées sur les particules (Figure 4-12 B e).

Ces résultats sont en accord avec les résultats de mesure des surnageants décrits dans la section 4.2.3. Cette fluorescence diminue après le processus complet de formation des sandwichs (Figure 4-12 C).

Figure 4-12 : Mesures de fluorescence à 532 nm des particules au cours des différentes étapes de la formation des sandwichs : (A) avant l’hybridation avec la cible (particules dans le PBS 0.3X), (B) Après ajout de 2,5 µM de cibles, hybridation et retrait de l’excès de cible par purification magnétique (dans le PBS 0.3X)

et (C) après le processus complet de formation des sandwichs dans le PBS 0.07X.

 Mise en évidence de la présence des particules fluorescentes

L’analyse de la fluorescence à 635 nm permet de mettre en évidence la présence des particules fluorescentes. Les résultats montrent que les particules magnétiques et la cible ont une fluorescence négligeable à cette longueur d’onde et n’interfèrent pas avec le signal obtenu pour les particules fluorescentes (Figure 4-13 A et B). Après le processus complet de formation des sandwichs, la fluorescence reste faible lorsque la cible est mise en présence de particules non fonctionnalisées. Ceci montre que les particules fluorescentes ne sont pas adsorbées sur les particules magnétiques (Figure 4-13 C f). Le signal de fluorescence observé

lorsque les particules fonctionnalisées ne sont pas en présence de cible est élevé (que les particules soit fonctionnalisées avec la sonde a ou avec la sonde b), contrairement à ce qui est attendu (Figure 4-13 C g). Lorsque la cible a est mise en présence de particules fonctionnalisées avec la sonde a (Figure 4-13 C h vert), le signal de fluorescence observé est environ 2 fois plus important que celui observé si la cible est mise en présence de particules fluorescentes fonctionnalisées avec la sonde b (Figure 4-13 C h violet). De plus, lorsque la

cible a est mise en présence des particules fonctionnalisées avec la sonde b, le signal de

fluorescence obtenu est similaire à celui obtenu pour le témoins négatifs (Figure 4-13 C f et g violet).

Figure 4-13 : Mesures de fluorescence par scanner à 635 nm des particules au cours des différentes étapes de la formation des sandwichs : (A) avant l’hybridation avec la cible (particules dans le PBS 0.3X), (B) Après ajout de 2,5 µM de cibles, hybridation et retrait de l’excès de cibles par purification magnétique (dans le PBS 0.3X)

et (C) après le processus complet de formation des sandwichs dans le PBS 0.07X.

 Interprétation et discussion

 En ce qui concerne la capture de la cible

La cible est capturée spécifiquement par les particules magnétiques fonctionnalisées et il y a peu d’adsorption non spécifique de la cible sur les particules non fonctionnalisées (comparaison f et h). Après le processus complet de formation des sandwichs, le signal de fluorescence attribué à la cible diminue. Ceci peut s’expliquer de deux manières. L’hybridation entre la cible et les sondes de capture portées par les particules magnétiques

s’est en partie dénaturée lors des lavages à 58°C. En effet, dans le CHAPITRE 3, nous avons vu que le rendement d’hybridation entre les sondes de capture et la cible à cette température est faible (5% de duplex formés, section 3.3.2 au paragraphe relatif aux conditions d’hybridation). Une autre hypothèse pouvant expliquer cette diminution de signal est qu’il y a un quenching du signal du Cy3 par le signal de fluorescence émis par les particules fluorescentes. Les résultats obtenus ici ne permettent pas de favoriser une hypothèse plutôt qu’une autre. De plus, la diminution du signal observé résulte sûrement d’une combinaison des deux hypothèses.

 En ce qui concerne la formation des sandwichs

Les résultats des mesures de fluorescence à 635 nm montrent qu’il y a peu d’adsorption non spécifique entre les particules lorsqu’elles ne sont pas fonctionnalisées. Lorsque la cible a est mise en présence de particules fluorescentes fonctionnalisées avec la sonde a, le signal de fluorescence obtenu est plus élevé que si les particules ajoutées sont fonctionnalisées avec la sonde b. Cela indique qu’il y a bien formation de sandwichs spécifiques (sonde a / cible a). La réalisation d’une analyse de variance (ANOVA) montre que le signal obtenu lors de la formation de sandwichs spécifiques est significativement différent à 90% de celui obtenu dans le cas où la cible a est mise en présence de particules fonctionnalisées avec la sonde b. De ce point de vue, le test permet de distinguer un allèle a d’un allèle b, qui différent entre eux d’un nucléotide. Toutefois, le signal de fluorescence attribué à la formation de sandwichs spécifiques n’est que 2,5 fois plus élevé que celui obtenu lors de la formation des sandwichs non spécifiques. Ce résultat est en accord avec ce qui est prédit par les modélisations réalisées au chapitre 3 et cela montre que les conditions de spécificité ne sont pas encore optimales. De plus, le signal de fluorescence obtenu lorsque les particules fonctionnalisées ne sont pas mises en présence de cible est élevé. Cela traduit une adsorption non spécifique ou une agrégation entre les particules. Le signal de fluorescence obtenu dans ce cas n’est pas significativement différent de celui obtenu lorsque les sandwichs spécifiques sont formés. Afin de savoir si ce résultat provient du système de capture d’ADN lui-même ou de la méthode de mesure, il est comparé par la suite aux résultats obtenus avec les autres méthodes de mesure de la fluorescence.

4.3.4 Mesures de fluorescence des sandwichs obtenues avec