Méthodes usuelles de typage plaquettaire : le génotypage par PCR et le phénotypage par MAIPA

Pour éviter les incompatibilités plaquettaires a priori ou pour en déterminer la cause

a posteriori, il est nécessaire de réaliser un groupage plaquettaire pour mettre en évidence

les antigènes présents à la surface des plaquettes. Il faut également déterminer si des anticorps dirigés contre ces antigènes sont présents dans le sang circulant du patient. Les antigènes recherchés en clinique sont les antigènes HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5, HPA-6, HPA-9 et HPA-15 sous leur forme a et b car ce sont ceux qui sont le plus souvent

impliqués dans des cas d’immunisation plaquettaire. Pour cela deux méthodes sont utilisées : le génotypage ou le phénotypage.

Actuellement, seul le génotypage permet de déterminer les antigènes présents à la surface des plaquettes. Le phénotypage ne peut pas être réalisé car les réactifs nécessaires ne sont pas disponibles. En effet, le phénotypage est une méthode sérologique basée sur la reconnaissance spécifique entre un antigène et l’anticorps qui lui est complémentaire. La détection d’antigènes par le phénotypage requiert des antisérums spécifiques contenant des anticorps monoclonaux permettant la reconnaissance d’un antigène donné. Les anticorps monoclonaux sont souvent produits de manière industrielle. Actuellement, les antisérums anti plaquettes ne sont pas disponibles pour tous les antigènes plaquettaires principalement impliqués dans les réactions immunitaires. Seuls des antisérums anti-HPA-1a et anti-HPA-5b sont disponibles, il n’existe actuellement pas d’antisérum pour la détection des autres systèmes HPA qu’il est nécessaire de rechercher pour avoir un diagnostic complet.

À défaut de pouvoir détecter de manière directe les antigènes à la surface des plaquettes, le génotypage est utilisé pour identifier les gènes codants pour les protéines de surface. Dans les cellules, lors du processus de transcription, les régions codantes de l’ADN sont transcrites en ARNm qui est traduit en acides aminés puis en protéine lors du processus de traduction de l’ARN (voir Figure 2-18). Une région d’ADN correspond donc à une protéine. Afin de déterminer les antigènes plaquettaires présents chez un individu, son ADN est étudié pour voir si la séquence codant pour la protéine qui porte cet antigène est présente. Le génotypage permet de déterminer le type d’allèle, « a » et / ou « b », que possède le patient pour chacun des groupes HPA. Pour cela, il est nécessaire d’extraire une quantité d’ADN suffisante et purifiée afin de pouvoir l’analyser. La méthode usuelle pour le génotypage est la PCR qui permet d’amplifier une région d’ADN spécifique en augmentant le nombre de copie d’ADN disponible. Les techniques de PCR les plus utilisées en laboratoire sont la PCR- SSP, la PCR-RFLP et la PCR en temps réel dont les principes ont été décrits précédemment (section 2.1.1).

Figure 2-18 : Schéma simplifié de la transcription et de la traduction d’un gène en protéine (© Université de Liège)

Pour certains antigènes plaquettaires, le groupage plaquettaire peut-être réalisé par phénotypage à l’aide de sérums provenant de patients immunisés. Pour cela, la technique de MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilization of Platelet antigens Assay), utilisée pour la détection des anticorps anti-plaquettes, est détournée : les anticorps seront connus, ce qui permettra d’identifier les antigènes (phénotypage). Hélas, cette stratégie ne peut être appliquée en routine car trop peu de sérums de patient et seuls quelques anticorps sont disponibles (anti-HPA-1a, 1b, 5b et en moindre quantité 5a ou 3a). De ce fait, il est impossible de typer les autres systèmes de groupes plaquettaires de cette manière par manque de réactifs. Cette méthode de phénotypage est utilisée uniquement pour confirmer le groupage plaquettaire réalisé par génotypage pour les plaquettes servant de panel afin de détecter les anticorps anti-plaquettes. En effet, dans certains cas, il arrive que l’information génétique ne se traduise pas au niveau protéique. La technique de phénotypage dérivée de la technique MAIPA permet de s’assurer, pour certains antigènes mis en évidence par génotypage, qu’ils sont bien exprimés à la surface des plaquettes.

À l’origine, la technique MAIPA décrite par Kiefel en 1987 (Kiefel et al, 1987) est utilisée dans les laboratoires d’immunologie plaquettaire pour détecter les anticorps anti- plaquettes. Pour cela, le sérum du patient ainsi qu’un anticorps (IgG) murin anti- glycoprotéine est mis en présence de plaquettes provenant d’un panel de donneurs dont le groupage plaquettaire est connu (grâce à une détermination antérieure). S’ils sont présents,

les anticorps se fixent sur les antigènes contre lesquels ils sont dirigés et forment des complexes immuns. Les plaquettes sont dénaturées afin de récupérer les complexes. Les glycoprotéines liées aux anticorps sont immobilisées sur une plaque à puits grâce à des anticorps anti-anticorps murins. Par la suite, la présence ou l’absence de l’allo-anticorps (et donc de l’antigène correspondant) est mise en évidence de manière indirecte grâce à des anticorps anti-anticorps humains marqués par une enzyme. La présence de cet anticorps secondaire est révélée par réaction enzymatique induisant une réaction colorée (Kiefel et al,

1987).

Pour diagnostiquer ou prévenir les réactions immunologiques résultant d’incompatibilité HPA lors d’une grossesse ou d’une transfusion, il est nécessaire de réaliser un groupage plaquettaire pour connaître les antigènes présents à la surface des plaquettes et de déterminer si des anticorps circulants sont présents dans le sang du patient. Le groupage plaquettaire ne peut pas être réalisé par phénotypage par manque d’antisérums, il est donc réalisé par génotypage. Les techniques décrites ici ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients.

2.6.4 Intérêts et enjeux de développer de nouvelles méthodes