Mesures de fluorescence des sandwichs obtenues par cytométrie en flu

 Principe

La cytométrie en flux permet de mesurer des événements passant de manière individualisée devant un faisceau laser. Les solutions sont injectées dans le cytomètre et les analyses sont faites sur 20 000 événements. Les résultats sont représentés sous forme d’histogrammes de fluorescence, afin de visualiser les différents événements.

 Résultats

 Analyse de la formation des sandwichs et de leur spécificité par cytométrie en flux La Figure 4-16 montre les histogrammes de fluorescence obtenus après l’analyse des différents échantillons par cytométrie en flux.

Les témoins montrent que le tampon et les particules magnétiques ont peu de contribution de fluorescence (Figure 4-16 a et c). Cette contribution correspond au bruit de fond du test et est délimitée par le marqueur M1 (intensité de fluorescence comprise entre 1 et 10 U.A.). Les particules fluorescentes fonctionnalisées ont une intensité de fluorescence importante située entre 330 et 10 000 U.A. Dans cette plage d’intensité de fluorescence, plusieurs pics sont observés. Un pic est bien marqué aux alentours de 400 U.A. et est représenté par le marqueur M3, et des pics plus petits sont présents entre 650 et 10 000 U.A. et sont représentés par le marqueur M4. Ce qui indique que les particules ont des intensités de fluorescence légèrement différentes.

Lors de la réalisation des essais, les populations correspondant aux particules non fluorescentes (M1) et aux particules fluorescentes libres (M3) sont présentes dans chaque échantillon avec des intensités différentes.

Après le processus de formation de sandwichs où la cible a est mise en présence de particules fluorescentes fonctionnalisées avec la sonde a, une nouvelle population de particules, dont l’intensité de fluorescence est comprise entre 10 et 330 U.A., apparait. Elle est délimitée par le marqueur M2. Cette population n’est pas présente sur les histogrammes de fluorescence des témoins ni sur les histogrammes de fluorescence observée pour les autres échantillons. De ce fait, cette population est attribuée à la formation de sandwichs spécifiques entre les particules magnétiques et fluorescentes en présence de la cible.

Afin de mieux comprendre la contribution de chaque population observée pour chaque échantillon, un histogramme de fluorescence est établi (Figure 4-17 A).

Figure 4-16 : Histogrammes de fluorescence obtenus par mesures de cytométrie en flux à 633 nm.

 Analyse de la contribution de chaque population à la fluorescence totale observée L’histogramme d’intensité de fluorescence est établi en suivant la formule suivante :

𝐹𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 = ∑(𝑁 ∗ 𝐼) + 0 10 ∑(𝑁 ∗ 𝐼) 10 330 +∑(𝑁 ∗ 𝐼) 330 650 + ∑ (𝑁 ∗ 𝐼) 650 10000 (4-5)

où N est le nombre de particules détectées et I est l’intensité de fluorescence en unité arbitraire (U.A.).

En considérant l’intensité de fluorescence totale, et lorsque les échantillons sont réalisés avec des particules fluorescentes fonctionnalisées avec les sondes a (complémentaire de la cible), l’intensité de fluorescence observée dans le cas où les

sandwichs se sont formés (Figure 4-17 A c) est 8,8 fois plus importante que celle des échantillons témoins (Figure 4-17 A a et b).

Lorsque les échantillons sont réalisés avec les particules fluorescentes fonctionnalisées avec des sondes b (non complémentaire de la cible, en rayé sur l’histogramme), l’intensité de fluorescence observée lorsque la cible a est mise en présence des particules fonctionnalisées (Figure 4-17 A c rayé) n’est pas significativement différente de celle observée lorsque la cible n’est pas présente dans l’échantillon (Figure 4-17 A b rayé). Toutefois, l’intensité de fluorescence observée pour l’échantillon où la cible a été mise en présence de particules non fonctionnalisées est élevée (Figure 4-17 A a rayé), mais présente un écart-type important. Cela laisse penser qu’il s’agit d’un point aberrant, comme cela est également observé lors de l’analyse par Evareader.

Si on analyse la fluorescence totale des échantillons, le signal observé lorsque les sandwichs spécifiques sont formés (Figure 4-17 A (c)) est 3 fois plus importante que celle observée lorsque les sandwichs non spécifiques sont formés (Figure 4-17 A (c) rayé).

En ce qui concerne les contributions de chaque population à l’intensité de fluorescence des échantillons, les populations délimitées par les marqueurs M3 et M4 ont les plus fortes contributions, puisqu’elles correspondent aux particules fluorescentes individualisées. La population délimitée par le marqueur M3 (en vert) a une contribution non négligeable pour l’échantillon où la cible est mise en présence de particules fonctionnalisées avec la sonde a, et semble correspondre à la formation des sandwichs spécifiques. La Figure 4-17 B montre l’histogramme d’intensité de fluorescence de cette population pour les différents échantillons.

A)

B)

Figure 4-17 : Histogrammes de fluorescence issus des mesures de cytométrie suite au processus complet de formation des sandwichs en présence de 2,5 µM de cible a. A) Contribution de chaque population fluorescente au signal de fluorescence total. B) Fluorescence attribuée à la population de particules

délimitée par le marqueur 2 (entre 10 et 330 U.A.) pour chaque échantillon.

 Analyse de la fluorescence attribuée à la formation des sandwichs (marqueur M2) La Figure 4-17 B montre que lorsque la population délimitée par le marqueur 2 est isolée, l’intensité de fluorescence observée lorsque les sandwichs spécifiques sont formés (Figure 4-17 B c sonde a) est significativement plus élevée que celle observée pour tous les autres échantillons. Cette intensité de fluorescence est environ 15 fois plus élevée que celle observée lorsque les sandwichs non spécifiques sont formés (Figure 4-17 B c sonde b).

 Interprétation et discussion

La cytométrie en flux permet de mesurer la fluorescence d’éléments passant de manière individualisée devant un faisceau laser. Elle permet de différencier plusieurs populations d’éléments en fonction de leur intensité de fluorescence. Les histogrammes de fluorescence permettent de visualiser une population de particules de faible intensité de fluorescence correspondant aux particules magnétiques seules (M1). Les particules fluorescentes fonctionnalisées seules présentent deux populations de particules avec une forte intensité de fluorescence (M3 et M4).

Tous les échantillons contiennent des particules magnétiques seules et des particules fluorescentes seules, puisque les pics caractéristiques de ces populations sont présents sur les histogrammes de fluorescence de chacun des échantillons.

Dans le cas de l’échantillon où les sandwichs spécifiques sont formés, une nouvelle population de particules apparaît. Cette population est attribuée aux sandwichs formés entre les particules magnétiques et fluorescentes en présence de la cible, car son intensité de fluorescence est située entre les intensités de fluorescence attribuées à ces deux types de particules. De plus, cette population n’apparaît pour aucun autre échantillon.

L’analyse du signal de fluorescence total de chaque échantillon montre que les résultats obtenus par cytométrie en flux sont en accord avec ceux obtenus avec l’Evareader et par imagerie de fluorescence. L’analyse de ces résultats montre qu’il y a peu d’adsorption non spécifique entre les particules. Le signal de fluorescence obtenue lorsque les sandwichs spécifiques sont formés est 3 fois supérieur en intensité à celui observé en présence de sandwichs non spécifiques. Ce ratio est légèrement supérieur à celui estimé par les simulations (ratio de 2,5) et également observé par Evareader et imagerie de fluorescence. Cela laisse penser que la cytométrie permet de mieux discriminer les signaux de fluorescence et donc la spécificité des sandwichs.

L’analyse de la population fluorescente représentée par le marqueur M2 présente un signal très élevé quand les sandwichs spécifiques sont formés, contrairement aux autres échantillons. Une analyse ANOVA montre que le signal de fluorescence obtenu lorsque les sandwichs spécifiques sont formés est significativement différent à 99,9% du signal observé lorsque la cible a est mise en présence de particules fonctionnalisées avec la sonde b. Le signal observé en présence de sandwichs spécifiques est 15 fois plus élevé que celui observé

en présence de sandwichs non spécifiques. Ce ratio est 5 fois plus important que celui observé lors de l’analyse du signal total de fluorescence.

L’outil de capture d’ADN couplé à une analyse par cytométrie en flux et une extraction du signal correspondant aux sandwichs permet donc de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1.

La cytométrie en flux est un outil qui permet de mieux comprendre ce qui se passe pour chaque échantillon et quelles sont les populations présentes dans chacun d’eux. Une analyse du signal a posteriori permet également d’isoler les populations d’intérêt pour diminuer le bruit de fond du test.

4.3.6 Comparaison des différentes techniques de détection de