UBF est un facteur essentielle pour la transcription ribosomale et pour

5.1.1.1 Le rôle d'UBF dans la formation du PIC

L'analyse de l'inactivation conditionnelle du gène Ubf en culture a permis de mettre en évidence que la perte d'UBF a causé un arrêt de la transcription ribosomale ainsi que des changements majeurs du profil de fixation des facteurs du PIC. Dès lors que la protéine était indétectable, nous avons observé une perte totale de la fixation de RPI sur les gènes d’ARNr, qui constitue l'étape limitante de l'initiation de la transcription ribosomale. Suite à la perte d'UBF, nous avons également observé la perte de la liaison du second facteur basal de la transcription ribosomale SL1 ainsi que celle du facteur TIFIA sur la répétition ribosomale. Ce qui démontre pour la première fois qu'UBF joue un rôle essentiel dans le recrutement des facteurs du PIC aboutissant au recrutement de l'ARN polymérase I sur les gènes d’ARNr, ainsi que pour la transcription ribosomale in vivo.

Les effets occasionnés par la perte d'UBF démontrent qu'UBF est un facteur de transcription essentiel pour la formation du PIC. Des travaux effectués in vitro suggèrent qu'UBF forme la structure de l'enhancesome aux éléments promoteurs CPE et UCE des gènes d'ARNr. On peut supposer que la perte d'une telle structure déstabilise la conformation des régions promotrices des gènes d’ARNr, ce qui déstabilise probablement par la même occasion la fixation du reste des facteurs de la transcription ribosomale. Il a également été proposé que la formation de l'enhancesome aux éléments promoteurs CPE et UCE oriente probablement les régions promotrices dans une conformation qui les juxtapose, et de ce fait, permet de faciliter leur reconnaissance par le complexe SL1. En plus de promouvoir la reconnaissance des éléments promoteurs par le complexe SL1, il a été décrit qu'UBF établit des contacts directs avec l'ARN polymérase I ainsi qu'avec le facteur SL1 (Beckmann et al., 1995; Hanada et al., 1996; Kwon and Green, 1994; Meraner et al., 2006; Panov et al., 2006b), ce qui stabilise probablement la fixation du reste des facteurs du PIC. Dans un contexte de perte d'UBF, on peut imaginer qui ceci entraine inévitablement la perte de la fixation des facteurs du PIC sur les gènes d’ARNr.

5.1.1.2 UBF induit un remodelage de la chromatine des gènes d’ARNr

L'inactivation conditionnelle du gène Ubf a entraîné une diminution le nombre de gènes d’ARNr actifs et a fortement modifié le profil des marques épigénétiques le long de la répétition d'ADNr. Nous avons remarqué une augmentation du niveau de fixation des marques épigénétiques répressives H3K9me3 et une diminution du niveau des marques épigénétiques actives H4Ac5. De la même manière, nous avons

observé une augmentation du niveau de l'histone H1 et de la protéine HP1 ainsi que la perte de la marque épigénétique active H1.4-S187p (Zheng et al., 2010) sur la répétition d'ADNr.

La liaison d'environ 146 pb d'ADN avec un dimère de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4 forme un core de nucléosome, qui est l'unité de base de la chromatine (Khorasanizadeh, 2004). Lorsque l'histone H1 se lie au core de nucléosome, H1 induit une hypercondensation de la chromatine, ce qui réduit l'accessibilité de la chromatine aux facteurs de transcription. Or, l'accessibilité de la chromatine aux facteurs de transcription est essentielle pour l'activation de la transcription. De la même manière, la fixation de la protéine HP1α favorise la compaction de la chromatine. Il est décrit que les résidus

H3K9Me3 sont reconnus par la protéine HP1α (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001) et que

cette interaction favorise le recrutement d'autres protéines responsables de l'hétérochomatinisation (Grewal and Jia, 2007).

D'après notre étude (Chapitre 2), il est clair que la liaison d'UBF aux gènes d’ARNr induit un changement de la chromatine des gènes d’ARNr, en déplaçant probablement les protéines menant à la formation de nucléosomes afin d'établir une structure ouverte des gènes d’ARNr. Dans des études in

vitro, un rôle d'anti-répresseur a été attribué à UBF1 lorsque celui-ci a été décrit comme permettant de

réprimer l'action inhibitrice de l'histone H1 sur le niveau de la transcription ribosomale, contrairement à son intermédiaire d'épissage UBF2 (Kuhn et al., 1994). Le mécanisme de cette fonction d'anti- répresseur a été en partie révélé lorsqu'il a été rapporté dans une étude in vitro que la fixation d'UBF déplace l'histone H1 pour la liaison aux core de nucléosomes (Kermekchiev et al., 1997).

La capacité d'UBF à induire un remodelage de la chromatine a été révélée dans deux études in vivo. Cette fonction d'UBF a été décrite dans une première étude portée sur l'effet du recrutement d'UBF sur le locus de l'opéron Lac, après la fusion d'UBF à l'élément répresseur de l'opéron qui est pourtant situé dans une région hétérochromatique du génome (Chen et al, 2004). L'effet du recrutement d'UBF a été analysé dans une seconde étude sur des sites pseudo-NORs de Xénope intégrés sur un chromosome non-acrocentrique de cellules humaines (Mais et al., 2005). Après recrutement d'UBF sur le locus de l'opéron Lac, une décondensation de la chromatine a été observée avec une diminution du recrutement

de la protéine HP1, ainsi que le recrutement de la machinerie transcriptionnelle. Après recrutement d'UBF sur les sites pseudo-NORs, un gap formé par une absence de marquage au DAPI sur le locus lors de la métaphase a été observé. La formation d'un gap en métaphase de la mitose est une caractéristique connue des NORs, c'est le résultat de leur décondensation par rapport à la chromatine environnante (Heliot et al., 1997). Le recrutement de la machinerie transcriptionnelle sur le locus pseudo-NORs a également été observé.

L'interaction d'UBF avec des protéines comme le facteur multi-fontionnel CTCF (Van den Nobelen et al, 2010), qui intervient entre autre dans l'organisation de la chromatine (Phillips and Corces, 2009), et avec l'histone déacétylase NAD+_{-dépendante SIRT7 (Grob et al., 2009) laisse suggérer qu'UBF permet}

de recruter des protéines intervenant dans le remodelage et dans l'organisation de la chromatine et de ce fait, de stabiliser la conformation active des gènes d’ARNr. Cette fonction d'UBF corrèle avec des études qui montrent qu’une réduction des niveaux protéiques d’UBF par siRNA empêche l'action de protéines intervenant dans le remodelage de la chromatine comme la chaperonne d'histones NPM1/B23 (Hisaoka et al., 2010) ou entraîne le recrutement des marques épigénétiques comme l'histone H1 (Sanij et al., 2008). Dans notre étude (Chapitre 2), nous avons également montré la présence de marques épigénétiques actives sur les gènes d'ARNr telles que les marques H4Ac5 ou H1.4-S187p en présence d'UBF, et que ces marquescont été perdues ou diminuées subséquemment à

la perte d'UBF, cela au profit de marques telles que la marque H3K9me3, l'histone H1, la protéine HP1.

Le remodelage de la chromatine des gènes d’ARNr est un mécanisme important qui affecte l'initiation de la transcription ribosomale et qui constitue de ce fait un moyen de régulation supplémentaire de cette dernière. Ce qui est illustré dans une étude (Muryama et al, 2008) décrivant que la chromatine des gènes d’ARNr est remodelée par le complexe Energy-dependent Nucleolar Silencing Complex (eNoSC). Il a été décrit dans cette étude que le complexe eNoSC serait composé des protéines Nucleomethyline (NML), l'histone déacétylase NAD+_{-dépendante SIRT1 ainsi que l'histone}

méthyltransférase Suv39H1. Ce complexe inhiberait la transcription ribosomale en induisant une conformation épigénétique répressive de la chromatine des gènes d’ARNr en condition de privation de nutriments. Cette régulation serait couplée à la présence en nutriments afin de restaurer un niveau d'énergie cellulaire basale pour éviter la mort cellulaire par apoptose.

5.1.1.3 UBF dans la régulation du nombre de gènes d'ARNr actifs

Dans notre étude qui porte sur l'analyse de l'inactivation conditionnelle du gène Ubf, nous avons constaté la perte des gènes d'ARNr actifs, ainsi que des changements importants des marques épigénétiques sur les gènes d'ARNr, avec une tendance vers un état épigénétique répressif de la transcription. Nous avons également constaté une augmentation du niveau de l'histone H2Az sur la région du promoteur. L'histone H2Az est considéré comme un marqueur des promoteurs en pause (Fan et al., 2002). Cependant, nous n'avons pas observé d'augmentation dans le niveau de la méthylation des gènes d’ARNr. Ces résultats suggèrent qu'en absence d'UBF, les gènes sont dans un état inactif, non méthylés mais potentiellement activables. L'ensemble de ces résultats révèlent qu'UBF est responsable de la dynamique entre des gènes inactifs potentiellement activables et des gènes activement transcrits pour la synthèse d'ARNr.

Il a été démontré dans des cellules murines qu'à peu près 50% des gènes d'ARNr sont actifs et que ce ratio est maintenu indépendamment de la progression dans le cycle cellulaire (Conconi et al., 1989) et du rythme de croissance cellulaire (Stefanovsky and Moss, 2006). Le maintien de ce ratio de gènes actifs est essentiel pour le bon fonctionnement de la biogenèse ribosomale ainsi que pour la stabilité génomique (Gagnon-Kugler et al., 2009). Ce ratio résulte d'au moins deux mécanismes: un mécanisme dépendant ainsi qu'un mécanisme indépendant de la méthylation des résidus CpG des gènes d'ARNr. Ce qui explique le maintien de ce ratio chez la levure, dépourvue de mécanisme de méthylation d'ADN. Dans l’étude portant sur la réduction des niveaux protéiques d’UBF à environ 20 % de son niveau normal par siRNA dans des cellules NIH3T3 (Sanij et al., 2008), il a été observé une diminution de 70% du nombre de gènes actifs par un mécanisme indépendant de la méthylation. Lorsque les marques épigénétiques ont été analysées, il a été constaté une augmentation de la fixation de l'histone H1 sur les gènes d'ARNr, sans changement significatif dans les marques épigénétiques répressives de la chromatine telle que la marque H3K9Me3. Ces effets ont été constatés sans changement du niveau de méthylation des sites promoteurs (Santoro and Grummt, 2001), ou dans le niveau de recrutement du complexe de remodelage de la chromatine NoRC (McStay et Grummt, 2003) dans l'établissement des gènes d'ARNr inactifs. Ces résultats ont permis de révéler la fonction d'UBF dans l'établissement d'une population des gènes d'ARNr active, sans faire intervenir la modification du niveau de méthylation des gènes d'ARNr.

Chez la levure il a été montré qu'Hmo1, un possible homologue d'UBF, est également fixé sur les régions promotrices ainsi que sur l'entière région codante des gènes d’ARNr (Hall et al., 2006), et seulement avec la portion active des gènes d’ARNr dépourvus d'histones (Merz et al., 2008b). Il a été démontré plus tard qu'Hmo1 est nécessaire pour maintenir l'état actif des gènes d’ARNr en absence de transcription par l'ARN polymérase I (Wittner et al., 2011). Dans cette étude, une souche de levure

hmo1Δ, rrn3-ts a été générée. Cette souche est mutante pour Hmo1 ainsi que pour Rrn3, qui est

essentiel à l'initiation de la transcription. L'analyse de cette souche a montré une conversion du nombre de gènes d'ARNr actifs vers un état inactif. Le mécanisme proposé dans cette étude serait qu'Hmo1 empêcherait l'assemblage des nucléosomes sur la répétition d'ADNr, afin de maintenir la portion active des gènes d'ARNr. Ces résultats suggèrent que les deux probables homologues UBF et Hmo1 partagent les mêmes fonctions pour l'établissement et le maintien du nombre de gènes d'ARNr actifs.