Chapitre 4: Analyse de la localisation des facteurs de la transcription ribosomale au sein de
4.4 Résultats
4.4.1 À 2.5 dpc, les facteurs de la transcription ribosomale sont localisés à la surface des
L'embryon à 2.5 dpc correspond à l'embryon sous sa forme 8-cellules ou morula après sa compaction (Rossant and Tam, 2009), il a alors subi 3 divisions cellulaires. Il a été décrit dans plusieurs études que la transcription ribosomale zygotique est active à ce stade (Piko and Clegg, 1982; Zatsepina et al.,
2003). L'utilisation de la technique d'immunofluorescence à l'aide de microscopie confocale est très appropriée afin d'étudier la localisation des facteurs de la transcription la transcription ribosomale, de même que les régions centromériques et l'hétérochromatine qui sont très peu étudiées à ce stade. Il a été montré qu'avant l'établissement des régions hétérochromatiques lors du développement embryonnaire précoce, que les régions centromériques subissent une réorganisation et s'organisent autour du NPB (Probst et al., 2007). Il est donc intéressant d'utiliser les embryons au stade pré- implantatoire afin d'étudier la dynamique des facteurs de la transcription ribosomale, des régions centromériques ainsi que la formation du nucléole lors du développement embryonnaire précoce. La formation du nucléole reste peu étudiée chez la souris et est mieux connue dans les modèles bovins et porcins.
L'isolation d'embryon à 2.5 dpc et 3.5 dpc m'a permis d'étudier la structure des NPB, la localisation des facteurs de transcription ribosomale ainsi que la localisation des régions centromériques. Nous disposons au laboratoire de sérums dirigés contre la grande sous-unité A194 de l'ARN polymérase I (RPI/A194), contre la protéine FIB et contre la région N-terminale d'UBF. Afin d'étudier la localisation des régions centromériques centriques, j'ai utilisé un sérum humain anti-CENP dirigé contre les protéines CENP-A, CENP-B et CENP-C. Les protéines CENP sont localisées exclusivement aux régions centromériques centriques, elles constituent donc un bon marqueur pour localiser cette région. J'ai également utilisé le marquage au DAPI, qui marque plus intensément les régions centromériques péricentriques.
J'ai d'abord voulu étudier la localisation des régions centromériques par rapport au marqueur du nucléole FIB dans ces cellules somatiques murines (Figure 4.1). Le DAPI est utilisé comme un marqueur de l'hétérochomatine ou de la chromatine péricentrique, alors que les CENP sont des marqueurs de la chromatine centrique (Weidtkamp-Peters et al., 2006). En utilisant les cellules NIH3T3, j'ai constaté que les régions centriques sont associées aux régions de l'hétérochomatine péricentrique, qui sont marquées plus intensément par le DAPI. Les séquences centromériques centriques et péricentriques sont flanquantes sur la région chromosomique, c'est la raison pour laquelle on retrouve leur immunocolocalisation partielle dans les cellules en culture (Figure 4.1). D'après mes observations, les régions centromériques étaient principalement situées à proximité de la membrane nucléaire et des nucléoles, comme il a déjà été observé (Weidtkamp-Peters et al., 2006).
Figure 4.1: Analyse de la localisation des protéines centromériques CENP. Immunolocalisation des
protéines centromériques CENP (représenté en magenta) et du marqueur nucléolaire FIB (représenté en vert) par immunofluorescence dans les cellules NIH3T3. Ces images sont des coupes d'une épaisseur de 0.5 m qui ont été obtenues à l'aide d'un objectif 63x.
Lorsque mes immunofluorescences étaient effectuées sur des embryons à 2.5 dpc (Figure 4.2), j'ai constaté que les protéines UBF, FIB et RPI sont localisées autour de la structure opaque des NPB à ce stade du développement embryonnaire. J'ai également constaté que ces mêmes protéines entourent presque toute la surface du NPB. Mes observations sont en accord avec celles qui proviennent d'une étude qui a porté sur l'analyse de la dynamique de la nucléologenèse dans les embryons de souris, autour du même stade embryonnaire (Geuskens and Alexandre, 1984). Dans cette étude, il a été observé un entourage progressif de la structure du NPB par un réseau réticulé comprenant plusieurs Centres Fibrillaires (FC) au stade 8-cellules. Dans l'étude, il a également été mis en évidence que ce réseau débutait son activité de synthèse d'ARN à ce stade. La localisation de ces marqueurs nucléolaires en surface des NPB révèle qu'à ce stade, les embryons sont encore dans le processus de nucléologenèse.
Figure 4.2: Analyse de la localisation des protéines centromériques et des facteurs de la transcription
ribosomale dans l'embryon précoce. a) b) Immunolocalisation des protéines centromériques CENP (représentées en gris), de RPI (représentées en rouge) et de FIB (représentées en vert) par immunofluorescence dans un embryon 8-cellules. c) Image par microscopie montrant la structure de l'embryon complet au stade 8-cellules. La barre d'échelle représente 15 m. Ces images sont des coupes d'une épaisseur de 0.5 m qui ont été obtenues à l'aide d'un objectif 63x.
En utilisant le marqueur anti-CENP, j'ai constaté un regroupement des régions centromériques dans plusieurs foci, qui localisent autour des NPB et de la membrane nucléaire. D'aprés mes observations, on peut constater que l'organisation des régions centromériques est différente dans les cellules somatiques NIH3T3 et dans les blastomères d'embryons au stade 8-cellules. Effectivement, dans les cellules somatiques, les régions centromériques sont séparées et sont distribuées ponctuellement dans la totalité de l'espace nucléaire. Dans la situation de l'embryon, les régions centromériques semblent être moins nombreuses, regroupées en plus grands foci et ces régions semblent être moins distribuées dans l'espace nucléaire.
La différence entre les deux types cellulaires est intéressante puisqu'il a été montré dans plusieurs études que l'arrangement des centromères est dépendant du type cellulaire et est décrit comme étant différent dans les cellules en différenciation (Beil et al., 2002; Brown et al., 2001; Chaly and Munro, 1996; Manuelidis, 1985; Terranova et al., 2005). Il a été proposé que cette différence d'organisation des régions centromériques contribuerait à l'expression ou à l'inactivation de certains gènes dont l'expression est tissu ou cellule-spécifique (Alcobia et al., 2000). De manière intéressante, l'expression des gènes d’ARNr a été décrite comme étant dépendante de l'organisation centromérique dans les cellules de Sertoli murines (Haaf et al., 1990). Dans cette étude, l'activité de la transcription ribosomale a été évaluée en comparant la structure des nucléoles dans des cellules de Sertoli actives ou inactives. Cette analyse a été effectuée par observation du profil de localisation de l'ARN polymérase I et de sa colocalisation avec Fibrillarine, par des expériences d'immunofluorescences. À partir de ces observations, la fusion préalable de plusieurs foci centromériques a été corrélée à l'activation de la transcription ribosomale dans ce type cellulaire. Dans le contexte de la présente étude, il est tentant de suggérer que ceci pourrait expliquer l'organisation différentielle en foci ou diffuse des régions centromériques dans les deux types cellulaires utilisés ici.