Les embryons n'exprimant pas UBF subissent un arrêt développemental entre les

développemental entre les stades 8-cellules et 16-cellules et possèdent une

structure des NPB altérée

Disposant d'un modèle de souris hétérozygotes pour la mutation du gène Ubf, j'ai voulu analyser l'effet de la perte d'expression d'UBF sur le développement embryonnaire, sur la localisation des facteurs de la transcription ribosomale et sur la nucléologenèse. En inter-croisant des souris UbfΔ/WT _{et en utilisant}

un sérum anti-UBF, j'ai pu analyser et distinguer la morphologie des embryons en situation UbfWT/WT _ou

UbfΔ/WT _{et Ubf}Δ/Δ_{. Mes tentatives de génotypage des embryons ont été sans succès dès lors que ces}

derniers étaient fixés au PFA, c'est la raison pour laquelle j'ai utilisé notre sérum anti-UBF qui a été généré dans notre laboratoire. L'utilisation du sérum anti-UBF m'a également permis de savoir jusqu'à quel point la protéine UBF maternelle est présente dans l'embryon.

Pour avoir un modèle de comparaison, j'ai utilisé notre modèle cellulaire UbfFlox/Flox_/ER-Cre +/+_{/Sv-T qui}

porte une mutation conditionnelle du gène Ubf et analysé la structure des nucléoles ainsi que l'organisation des régions centromériques lors de la perte du gène Ubf (Figure 4.4). En situation contrôle, j'ai constaté une colocalisation des marqueurs du nucléole RPI et FIB ainsi qu'une organisation des régions centromériques dans les régions de l'hétérochromatine, qui sont disposées sur toute la surface nucléaire et autour des nucléoles.

La perte d'UBF a induit une altération de la structure nucléolaire pour ne laisser apparaître qu'une structure résiduelle désorganisée, où les protéines RPI et FIB localisent (comme vu dans le Chapitre 2). J'ai également remarqué une séparation dans la localisation des protéines RPI et FIB, qui semblent exclusives. Cette perte de colocalisation semble suggérer une séparation des domaines Fibrillar Center (FC) et Dense Fibrillar Component (DFC) du nucléole. Il a été montré que ce phénomène est attribuable à un stress dans la structure nucléolaire (Olson and Dundr, 2005; Sirri et al., 2008). Le même effet est observé lorsqu'on inhibe la transcription ribosomale avec un anticorps dirigé contre l'ARN polymérase I (Benavente et al., 1987) ou lorsqu'on traite les cellules avec de l'actinomycine D (Ochs et al., 1985). L'actinomycine D qui est un inhibiteur de la synthèse d'ARN et pour lequel l'ARN polymérase I est plus sensible par rapport aux deux autres ARN polymérases (Bensaude, 2011; Perry and Kelley, 1970). Cependant, l'organisation des régions centromériques ne semble pas être significativement altérée, mise à part une tendance à former des foci moins importants à la périphérie des nucléoles.

Figure 4.4: Analyse de la structure nucléolaire et des régions centromériques après inactivation du

gène Ubf dans les cellules UbfFlox/Flox_/ER-Cre +/+_{/Sv-T. Comparaison de l'organisation de la structure}

nucléolaire et des régions centromériques par immunolocalisation d'RPI (représentée en rouge), de FIB (représentée en vert) et des protéines CENP (représentées en gris). Ces images sont des projections maximales qui résultent de la superposition de coupes d'une épaisseur de 0.5 m, qui ont été obtenues à l'aide d'un objectif 63x. pHT: Post-HydroxyTamoxifen.

L'isolation des embryons à 3.5 dpc m'a permis de révéler que les embryons n'exprimant pas UBF subissaient systématiquement un arrêt développemental entre les stades 8-cellules et 16-cellules (Figure 4.5 et 4.6). Sur les 53 embryons analysés, 8 d'entre eux n'exprimaient pas UBF, et aucun d'entre eux n'a pu progresser jusqu'au stade 16-cellules. En effet, ces derniers sont systématiquement arrêtés entre les stades 8-cellules et 16-cellules (Figure 4.6).

Figure 4.5: Analyse de la structure nucléolaire et de la localisation des régions centromériques après

inactivation du gène Ubf dans les embryons précoces à 3.5 dpc. Analyse de la localisation des protéines UBF, FIB, CENP (a à f) et UBF, RPI, FIB (g à l), au sein d'embryons n'exprimant pas UBF. Comparaison de l'organisation de la structure nucléolaire et des régions centromériques par a) b) d) e) immunolocalisation d'UBF (représentée en vert), de FIB (représentée en rouge) et des protéines CENP (représentées en gris) et par g) h) j) k) immunolocalisation d'UBF (représentée en vert), de RPI (représentée en rouge) et de FIB (représentée en gris) à 3.5 dpc. c) f) i) l) Image par microscopie montrant la structure de l'embryon complet aux stades embryonnaires respectifs. Les barres d'échelle représentent respectivement 17, 16, 17 et 19 m. Ces images sont des coupes d'une épaisseur de 0.5 m qui ont été obtenues à l'aide d'un objectif 63x.

Dans les embryons au stade 16-cellules qui sont positifs pour l'expression d'UBF (Figure 4.4a), j'ai observé une organisation des régions centromériques majoritairement autour des NPB et à proximité de la membrane nucléaire, et minoritairement dans le reste de l'espace nucléaire. En observant le marquage au DAPI, qui marque plus intensément les régions de l'hétérochromatine péricentrique, on peut constater une organisation en forme circulaire autour des NPB, qui semble adjacente à la localisation des protéines UBF et FIB jusqu'au stade blastocyste (Figure 4.4a à Figure 4.4c).

Dans les embryons négatifs pour l'expression d'UBF, j'ai observé une altération de la structure du réseau pré-nucléolaire où les protéines RPI et FIB localisent. Également, j'ai constaté que ces dernières ne localisaient plus à la surface des NBP, mais localisaient dans une structure nucléaire désorganisée. Lorsque je me suis intéressé à l'organisation des régions centromériques dans les embryons négatifs pour l'expression d'UBF, j'ai constaté la présence d'imposants blocs d'hétérochromatine péricentrique dans l'ensemble du noyau. Également, j'ai pu constater que le marquage des protéines CENP était moins intense dans le cas des embryons négatifs pour l'expression d'UBF.

Si l'on compare les deux situations, dans les embryons exprimant UBF, l'hétérochromatine semble organisée et forme un anneau autour des NPB. Lorsque l'expression d'UBF est perdue, l'hétérochromatine semble désorganisée, la structure en anneau autour des NPB et située au centre du noyau est perdue et on peut voir apparaître des blocs d'hétérochomatine au centre du noyau ainsi qu'à proximité de la membrane nucléaire.

Figure 4.6: Tableau récapitulatif de l'analyse des embryons à 3.5 dpc, obtenus après inter-croisement

des souris Ubf Δ/WT _{et après l'analyse de la présence d'UBF par immunofluorescence.}