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Étude du rôle du facteur de transcription UBF dans la régulation de la transcription ribosomale "in vivo"

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Academic year: 2021

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Texte intégral

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ÉTUDE DU RÔLE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION

UBF DANS LA RÉGULATION DE LA

TRANSCRIPTION RIBOSOMALE IN VIVO

Thèse

ABDELATIF NOURDINE HAMDANE

Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire

Philosophiæ Doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

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Résumé

La biogenèse ribosomale débute avec la transcription de l'ARN ribosomal (ARNr). La structure du nucléole, la formation des ribosomes et le recrutement des centaines de protéines et de Small

Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) qui sont essentiels pour la biogenèse ribosomale dépendent de

l'activité transcriptionnelle des gènes d’ARNr. Les génomes haploïdes murins et humains possèdent à peu près 200 copies de gènes d’ARNr présents sur le bras court de cinq chromosomes acrocentriques. Ces loci correspondent aux Nucleolar Organizer Regions (NORs) et restent en majorité hypocondensés par rapport au reste des chromosomes durant la mitose. Au commencement de chaque cycle cellulaire, les nucléoles se reforment autour des gènes d’ARNr actifs. Ces gènes d’ARNr sont transcrits par l'ARN polymérase I, ce qui nécessite la formation d'un complexe de pré-initiation de la transcription (Pre-Initiation Complex, PIC). À partir d'expériences in vitro, deux facteurs basaux pour l'ARN polymérase I ont été identifiés: Selectivity Factor 1 (SL1) et Upstream Binding Factor (UBF). Le complexe SL1 contient la protéine TATA-box Binding Protein (TBP) ainsi que plusieurs TBP-Associated

Factor (TAF) qui permettent de reconnaître les séquences promotrices des gènes d’ARNr. Les

données existantes à ce jour suggèrent qu'UBF est un facteur architectural qui permet la formation d'une structure nucléoprotéique, l'enhancesome, dans laquelle un dimère d'UBF forme une boucle d'ADN de 360° d'environ 140 paires de bases (pb) d'ADN, et de ce fait, aide à la formation du PIC. UBF a également été impliqué dans la régulation de l'élongation de la transcription. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si UBF accomplit ces deux fonctions in vivo et si UBF est essentiel pour la transcription des gènes d'ARNr.

Pour résoudre cette question fondamentale, nous avons généré des souris ainsi que des cellules murines qui portent une mutation conditionnelle du gène Ubf. L'inactivation du gène Ubf a entraîné un arrêt développemental au stade morula, ceci révélant l'importance du facteur pour la prolifération des cellules et pour le développement embryonnaire. L'inactivation conditionnelle du gène Ubf en culture cellulaire a mené à l'arrêt de la transcription ribosomale, à l'absence de formation du complexe PIC sur les gènes d’ARNr, à la mise en état inactif des gènes d’ARNr sans méthylation de l'ADN, à l'altération de la structure nucléolaire et à la formation d'une structure nucléaire qui contient les facteurs de l'initiation de la transcription et de la maturation des ARNr mais qui est dépourvue des NORs. L'inactivation conditionnelle d'Ubf dans les cellules a conduit à un arrêt de la prolifération cellulaire et à l'apoptose des cellules de manière indépendante p53, et ceci exclusivement dans les cellules transformées de manière oncogénique. Ces résultats suggèrent qu'UBF constituerait une cible de choix

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Abstract

Ribosomal biogenesis starts with transcription of ribosomal RNA (rRNA). Nucleolus structure, ribosomes formation and recruitment of hundreds of proteins and snoRNAs Small Nucleolar

Ribonucleic Acid essential for ribosomal biogenesis depend on transcription of rRNA. Human and

mouse haploid genomes contain around 200 copies of rDNA genes on the short arms of five acrocentric chromosomes. These loci correspond to the NORs Nucleolar Organizer Regions and stay undercondensed during mitosis as compared with the rest of the chromosomes. At the beginning of each cell cycle, nucleoli are reformed around rDNA genes. rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I, which requires the formation of the PIC. Two RNA polymerase I basal transcription factors were identified; SL1 Selectivity Factor 1 and UBF Upstream Binding Factor. The SL1 complex contains the TBP TATA-box Binding Protein protein and the TAF TBP-Associated Factor allowing the promoter sequences recognition on rDNA genes. Data suggest that UBF is an architectural factor that allows the formation of a nucleoproteic structure, the enhancesome, in which a UBF dimer forms a DNA loop of 360° of almost 140 bp of DNA and in this way aids PIC formation. However, UBF has also been implicated in the regulation of transcription elongation. But whether or not UBF actually performs either of these functions in vivo, or indeed is even essential for the transcription of the rRNA genes at all is still unknown. To resolve this fundamental question we have generated mice and mouse cells conditionally lacking the single copy Ubf gene. Inactivation of the Ubf gene in mouse leads to developmental arrest at morula stage, this revealing the factor's importance for cell proliferation and embryonic development. Conditional inactivation of Ubf gene in cell culture leads to shut-down of ribosomal transcription, to failure of PIC formation loss on rDNA genes, to a DNA methylation-independent inactivation of rDNA genes, to nucleolus structure alteration and to the formation of a sub-nuclear structure containing the initiation of transcription and the processing factors lacking the NORs. Conditional inactivation of Ubf gene in cells leads to a proliferation cell arrest and to a p53-independent apoptosis exclusively in oncogenically transformed cells, suggesting that UBF could represent a unique target for chemotherapy.

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Table des matières

Résumé ... III Abstract ... V Table des matières ... VII Liste des figures ... XI Liste des abréviations ... XV Remerciements ... XIX

Chapitre 1: Introduction ... 1

1.1 Les gènes d'ARNr ... 1

1.1.1 Organisation des gènes d'ARNr ... 1

1.1.2 NORs: Nucleolar Organizer Regions... 3

1.1.3 Épigénétique des gènes d’ARNr ... 4

1.1.3.1 État épigénétique des gènes d’ARNr chez les eucaryotes ... 5

1.1.3.1 État chromatinien des gènes d’ARNr chez les mammifères ... 8

1.1.3.2 La méthylation de l'ADN chez les mammifères ... 10

1.1.3.3 Les modifications post-traductionnelles des histones chez les mammifères ... 12

1.1.3.4 Fonctions des copies en extra des gènes d’ARNr ... 13

1.2 Le nucléole ... 14

1.2.1 Le nucléole, site de "fabrication" des ribosomes ... 14

1.2.1.1 Transcription et maturation de l'ARNr ... 15

1.2.1.2 Assemblage des ribosomes ... 17

1.2.2 Constitution du nucléole ... 17

1.2.3 Fonctions extra-ribosomales ... 18

1.2.3.1 Processus liés à des ARN ... 19

1.2.3.2 Régulation des suppresseurs de tumeurs, du cycle cellulaire, de la réparation d'ADN 19 1.3 Les facteurs de la transcription ribosomale ... 20

1.3.1 UBF ... 20

1.3.2 SL1 ... 22

1.3.3 TIFIA/Rrn3 ... 23

1.3.4 TTF-I ... 23

1.3.5 L'ARN polymérase I... 25

1.4 Modèle de l'initiation de la transcription ribosomale ... 26

1.4.1 Formation du PIC ... 26

1.4.2 Modèle de l'holoenzyme ... 28

1.5 Modulation de la transcription ribosomale ... 28

1.5.1 Ciblage des acteurs de la transcription ribosomale ... 29

1.5.1.1 UBF ... 30

1.5.1.2 SL1 ... 33

1.5.1.3 TIFIA/RP1 ... 34

1.5.1.4 TTF-I ... 35

1.5.2 La plasticité du nombre de gènes actifs et du niveau transcriptionnel par gène ... 36

1.6 Biogenèse ribosomale et pathologies ... 38

1.6.1 Ribosomopathies ... 38

1.6.2 Cancer ... 39

1.6.2.1 p53 ... 41

1.6.2.2 MYC ... 43

(8)

1.7 UBF, un facteur clé au sein de la transcription ribosomale ... 46

1.7.1 Les protéines HMG ... 46

1.7.1.1 La famille des protéines HMG ... 46

1.7.2 Le facteur de transcription UBF ... 48

1.7.3 Structure/fonction du facteur UBF ... 51

1.7.4 Fonctions d'UBF au sein de la transcription ribosomale ... 52

1.7.4.1 UBF dans la formation du PIC ... 52

1.7.4.2 UBF permet d'établir la structure ouverte des gènes d’ARNr ... 53

1.7.4.3 Rôle d'UBF dans la connexion entre des facteurs de croissance et la prolifération cellulaire ... 55

1.7.5 Hmo1, un probable homologue d'UBF chez la levure ... 56

1.7.5.1 Structure/fonction de la protéine Hmo1 ... 56

1.7.5.2 La protéine Hmo1 ... 56

1.8 Étapes majeures du développement embryonnaire précoce chez la souris ... 59

1.8.1 La formation du stade blastocyste ... 60

1.8.2 ZGA: L'activation du génome zygotique ... 61

1.8.3 La transcription ribosomale et la formation du nucléole ... 65

1.8.3.1 La nucléologenèse ... 65

1.8.3.2 L'initiation de la transcription ribosomale ... 69

1.8.4 La reprogrammation épigénétique du génome et l'établissement de l'hétérochromatine ... 71

1.8.4.1 Reprogrammation épigénétique du génome ... 72

1.8.4.2 L'établissement de l'hétérochromatine ... 73

1.9 Problématique et Objectifs ... 75

Chapitre 2: L'inactivation conditionnelle de Upstream Binding Factor révèle ses fonctions épigénétiques et l'existence d'un Nucleolar Precursor Body somatique; ... 77

«Conditional Inactivation of Upstream Binding Factor Reveals Its Epigenetic Functions and the Existence of a Somatic Nucleolar Precursor Body» ... 77

2.1 Avant Propos... 78

2.2 Résumé ... 78

2.3 Abstract ... 79

2.4 Introduction ... 79

2.5 Results ... 81

2.5.1 UBF is essential for mouse development ... 81

2.5.2 UBF is essential for transcription of the rRNA genes in vivo ... 83

2.5.3 UBF associates specifically with the rRNA gene enhancer and 47S transcribed regions. .... 83

2.5.4 UBF is necessary for the formation of the RPI initiation complex and RPI recruitment ... 84

2.5.5 Association of the transcription termination TTF1 with the rDNA is independent of UBF ... 85

2.5.6 Recruitment of RPI to the Enhancer (Spacer) Promoter and 47S promoter are distinctly different ... 85

2.5.7 Loss of UBF induces changes in the rDNA chromatin, but not CpG methylation ... 87

2.5.8 H1 variant H1.4 associates with the active rDNA in a UBF-dependent manner ... 89

2.5.9 UBF is not required for 47S rRNA processing nor for 5S rRNA or U3 RNA synthesis ... 90

2.5.10 UBF elimination does not significantly affect expression of ribosome biogenesis genes .... 90

2.5.11 Nucleolar factors congregate in large nucleolar bodies after UBF elimination ... 91

2.5.12 Nucleolar bodies are not associated with the rRNA gene loci ... 93

2.6 Conclusions... 96

2.7 Materials and Methods ... 98

2.8 Acknowledgements ... 102

(9)

Chapitre 3: La perte d'UBF induit l'apoptose indépendamment du statut de p53; ... 117

«Loss of UBF induces apoptosis independently of p53 status» ... 117

3.1 Avant Propos ... 118

3.2 Résumé ... 118

3.3 Abstract ... 119

3.4 Introduction ... 119

3.5 Results ... 123

3.5.1 UBF is essential for ribosomal transcription in vivo in primary MEFs cells. ... 123

3.5.2 UBF loss blocks proliferation and DNA replication, causing cell cycle arrest. ... 125

3.5.3 Ubf gene inactivation causes apoptosis only in oncogenically transformed cells. ... 125

3.5.4 Apoptosis is accompanied by the generation of a “nucleosomal ladder” of DNA cleavage. ... 126

3.5.5 Apoptosis of oncogenically transformed cells after Ubf gene inactivation is p53 independent. ... 127

3.5.6 p53 independent apoptosis is a general response to UBF loss in oncogenically stressed cells... 129

3.6 Conclusion ... 131

3.7 Materials and Methods ... 134

3.8. Acknowledgements... 136

Chapitre 4: Analyse de la localisation des facteurs de la transcription ribosomale au sein de l’embryon précoce chez la souris; ... 141

4.1 Avant Propos ... 142

4.2 Objectifs ... 143

4.3 Matériel et méthodes ... 144

4.4 Résultats ... 145

4.4.1 À 2.5 dpc, les facteurs de la transcription ribosomale sont localisés à la surface des NPB, autour desquels s'organisent les régions centromériques ... 145

4.4.2 A partir du stade morula, la structure nucléolaire change, se réticulise et les régions centromériques se réorganisent et acquièrent l'organisation d'une cellule somatique ... 149

4.4.3 Les embryons n'exprimant pas UBF subissent un arrêt développemental entre les stades 8-cellules et 16-cellules et possèdent une structure des NPB altérée ... 154

4.5 Discussions ... 161

4.6 Perspectives ... 163

Chapitre 5: Discussion et Conclusion ... 165

5.1 Discussion ... 165

5.1.1 UBF est un facteur essentielle pour la transcription ribosomale et pour sa régulation ... 165

5.1.1.1 Le rôle d'UBF dans la formation du PIC ... 165

5.1.1.2 UBF induit un remodelage de la chromatine des gènes d’ARNr ... 166

5.1.1.3 UBF dans la régulation du nombre de gènes d'ARNr actifs ... 168

5.1.2 Le rôle d'UBF dans la régulation de la transcription ribosomale ... 169

5.1.3 Rôle d'UBF dans la prolifération et la différenciation cellulaire ... 170

5.1.4 L'arrêt développemental des embryons Ubf-/- ... 172

5.1.5 Rôle d'UBF dans la nucléologenèse et dans l'organisation des centromères ... 174

5.2 Conclusion et Perspectives ... 175

(10)
(11)

Liste des figures

Figure 1.1: L'organisation des gènes d'ARNr ... 2

Figure 1.2: Régions organisatrices du nucléoles ... 3

Figure 1.3: UBF reste fixé sur les gènes d’ARNr actifs durant la mitose ... 4

Figure 1.4: Schéma représentant l'analyse de l'état épigénétique de la chromatine des gènes d’ARNr par crosslink au psoralène chez S. cerevisiae ... 6

Figure 1.5: États épigénétiques des gènes d’ARNr chez les mammifères ... 9

Figure 1.6: Représentation de la régulation de l'état épigénétique des gènes d’ARNr par CSB et NoRC ... 11

Figure 1.7: Modifications post-traductionnelles majeures des histones et leur rôle biologique ... 12

Figure 1.8: L'organisation du nucléole... 15

Figure 1.9: Modèle représentant la maturation de l'ARNr et l'assemblage des ribosomes matures chez l'humain ... 16

Figure 1.10: Le nucléole ...18

Figure 1.11: Rôle d’UBF dans la formation du PIC... 21

Figure 1.12: Sous-unités de l'ARN polymérase I chez la levure S. cerevisiae et chez l'humain ... 25

Figure 1.13: Représentation du modèle du PIC de la transcription par l'ARN polymérase I sur une unité de gène d’ARNr ... 27

Figure 1.14: Régulation de la transcription ribosomale en réponse aux signaux externes ... 29

Figure 1.15: La régulation de la transcription ribosomale par ciblage de ses acteurs principaux via des modifications post-traductionnnelles ... 31

Figure 1.16: Régulation de la transcription ribosomale par les proto-oncogènes et suppresseurs de tumeurs ... 34

Figure 1.17: ARF et NPM1/B23 dans la régulation de la synthèse d'ARNr ... 36

Figure 1.18: Défauts de la biogenèse ribosomale et ribosomopathies ... 39

Figure 1.19: Schéma représentant les altérations dans la biogenèse ribosomale qui pourraient potentiellement mener au cancer ... 40

Figure 1.20: p53 dans le contrôle qualité de la biogenèse ribosomale ... 42

Figure 1.21: Régulation de l'expression des acteurs de la biogenèse ribosomale et de la synthèse protéique par MYC ... 44

Figure 1.22: Rôle de NPM1/B23 dans la transformation cellulaire ... 46

Figure 1.23: La famille des protéines HMG ... 48

Figure 1.24: Structure d'UBF et de ses variants d'épissage chez différentes espèces ... 50

Figure 1.25: Le rôle d'UBF dans l'initiation de la transcription ribosomale ... 53

Figure 1.26: Modèle de la régulation de la transcription ribosomale par les facteurs de croissance .... 55

Figure 1.27: Représentation de la conservation de l’organisation et de la séquence primaire des parties N-terminales d'UBF et de ses probables homologues Hmo1 et Sp-Hmo1 chez la levure ... 57

Figure 1.28: Immunolocalisation des protéines UBF et Hmo1 dans des cellules humaines lors de l'interphase et de la mitose ... 58

Figure 1.29: Représentation des changements structuraux lors des trois premiers jours du développement embryonnaire chez la souris ... 61

Figure 1.30: Comparaison de la transition maternelle-zygotique chez plusieurs organismes ... 64

Figure 1.31: Modèle de formation du nucléole interne et externe au NPB lors du développement embryonnaire ... 67

Figure 1.32: Formation du nucléole chez la vache et le porc ... 69

Figure 1.33: Niveaux d'ARN totaux, d’ARN ribosomaux et de ribosomes à différents stades du développement embryonnaire précoce chez la souris ... 70

(12)

Figure 1.34: Le cycle de reprogrammation épigénétique ... 72

Figure 1.35: Les régions centromériques et la formation des chromocentres ... 74

Figure 2.1. The Ubf gene is essential for mouse development beyond morula ... 82

Figure 2.2. UBF is essential for the synthesis of the major rRNAs in cell culture ... 84

Figure 2.3. UBF elimination causes release of the RPI and all RPI initiation factors, but not of the termination factor TTF1 ... 86

Figure 2.4. The rDNA chromatin is extensively remodelled during UBF elimination ... 88

Figure 2.5. UBF elimination has only minor effects on global gene expression ... 89

Figure 2.6. UBF elimination reveals that nucleolar protein bodies exist independently of rRNA gene activity ... 92

Figure 2.7. Somatic Nucleolar Precursor Bodies are distinguished from nucleoli by not being visible in bright field ... 93

Figure 2.8. Nucleolar bodies are spatially distinct from the rDNA and NORs ... 94

Figure 2.9. A model for the chromatin structure of the three distinct states of rRNA gene activity ... 95

Figure 2.S1. The mouse (m)Ubf gene is essential for mouse development beyond morula ... 109

Figure 2.S2. Time course of ER-Cre induced recombination at the UBF locus in Ubffl/fl/Er-cre+/+cells treated with 50nM 4-HT for 4h ... 110

Figure 2.S3. Map of the rDNA repeat showing the sites (amplicons) sampled by ChIP analysis ... 111

Figure 2.S4. DNA CpG methylation assays of Ubffl/fl/Er-cre+/+ and Ubffl/fl/Er-cre+/+ cells at the given times after 4-HT treatment ... 112

Figure 2.S5. Unbiased gene enrichment plots of expression microarray data corresponding to the Boxplots shown in Figure 2.5A ... 113

Figure 2.S6. Single optical sections from 3D IF image stacks of Ubffl/fl/Er-cre+/+ cells stained for UBF, RPI (large subunit, A194), Rrn3/TIF1A or TTF1 and for Fibrillarin, and counter-stained with DAPI, at the indicated times post 4-HT treatment ... 114

Figure 2.S7. Ubffl/fl/Er-cre+/+ cell metaphase spreads were stained for rDNA by FISH (green) and counterstained with DAPI (red) ... 115

Figure 3.1. UBF loss arrests cell proliferation and lead to a cell cycle arrest ...122

Figure 3.2. UBF loss induces selective apoptotic cell death synchronously in transformed iMEFs cells... 124

Figure 3.3. UBF loss induces selective Caspase 3 cleavage in transformed iMEFs cells ... 127

Figure 3.4. Apoptosis of oncogenically transformed cells after Ubf gene inactivation is p53 independent ... 128

Figure 3.5. p53 independent apoptosis is a general response to UBF loss in an oncogenic stress context... 130

Figure 3.6. UBF is necessary for oncogenically transformed cells proliferation ... 133

Figure 3.S1. UBF is essential for ribosomal transcription in primary MEFs ... 137

Figure 3.S2. UBF elimination in primary MEFs also leads to an alteration of nucleolar structure and gives rise to proteinaceous Nucleolar Bodies ... 138

Figure 3.S3. UBF loss leads to a cell cycle arrest and to a loss of division ... 139

Figure 3.S4. Ubf gene inactivation leads to apoptotic cell death after an oncogenic stress ... 140

Figure 4.1: Analyse de la localisation des protéines centromériques CENP ... 147

Figure 4.2: Analyse de la localisation des protéines centromériques et des facteurs de la transcription ribosomale dans l'embryon précoce ... 148

Figure 4.3: La structure du NPB et l'organisation des régions centromériques se réorganisent lors de la formation du blastocyste ... 150

Figure 4.4: Analyse de la structure nucléolaire et des régions centromériques après inactivation du gène Ubf dans les cellules UbfFlox/Flox/ER-Cre +/+/Sv-T...155

Figure 4.5: Analyse de la structure nucléolaire et de la localisation des régions centromériques après la perte d'UBF dans les embryons précoces à 3.5 dpc ...156

(13)

Figure 4.6: Tableau récapitulatif de l'analyse de la progénie à 3.5 dpc obtenue après

intercroisement des souris Ubf Δ/WT et analyse la présence d'UBF par immunofluorescence...161

Figure 4.7: Analyse de la localisation des gènes d’ARNr et des séquences centromériques

(14)
(15)

Liste des abréviations

Ac: Acetyl

ADN: Acide désoxyribonucléique

ADNr: Acide désoxyribonucléique ribosomal Alb-Cre: Albumin-Cre

ATP: Adénosine Triphosphate ARN: Acide ribonucléique

ARNm: Acide ribonucléique messager ARNr: Acide ribonucléique ribosomal ARNt: Acide ribonucléique de transfert BAC: Bacterial Artificial Chromosome bp: Base pair

BrUTP: 5-Bromouridine-5'-triphosphate CAT: Chloramphenicol Acetyl Transferase Cdk: Cyclin Dependent Kinase

ChIP: Chromatin Immonoprecipitation CPE: Core Promoter Element CpG: Cytosine Phosphate Guanine CF: Core factor

ChEC: Chromatin Endogenous Cleavage DAPI: 4',6-diamidino-2-phenylindole DFC: Dense Fibrillar Component

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DNMT: DNA Methyltransferase

Dpc: Days post coitum

E: Embryonic day E. coli: Escherichia Coli EGF: Epidermal Growth Factor

eNoSC: Energy-dependent Nucleolar Silencing Complex ER-Cre: Estrogen Receptor Cre recombinase

ES: Embryonic Stem Cell EtBr: Ethidium Bromide

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FC: Fibrillar Center

FGF: Fibroblast Growth Factor FIB: Fibrillarine

FISH: Fluorescence In Situ Hybrydization FITC: Fluorescein Isothiocyanate Flox: LoxP-Flanked

FLPer: Flipper

FRAP: Fluorescence Recovery after Photobleaching FRT: Flippase Recognition Target

GC: Granular Component

GTFs: General Transcription Factors G418: Généticine

HAT: Histone Acetyl Transferase hCG: Human Chorionic Gonadotropin HCV: Virus de l'Hépatite C

HDAC: Histone Deacetylase HMG: High Mobility Group HMT: Histone Methyltransferase HP1: Heterochromatin Protein 1 HPV: Papillomavirus humain ICM: Masse Cellulaire Interne IF: Immunofluorescence IGF: Insulin-like Growth Factor IGS: Intergenic Sequence IP: Immunoprécipitation

IRES: Internal Ribosome Entry Site ITS: Internal Transcribed Spacer KO: Knockout

KD: Knockdown

MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase Me: Methyl

MDM2: Mouse Double Minute 2

MEF: Fibroblaste Embryonnaire de Souris mTOR: MechanisticTarget of Rapamycin NBD: Nucleosome Binding Domain

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NLB: Nucleolus Like Bodies NoDS: Nucleolar Detention Signal NoLs: Nucleolar Localization Sequence NORs: Nucleolar Organizer Regions NoRC: Nucleolar Remodeling Complex NPB: Nucleolar Precursor Body NPM1: Nucleophosmin 1 pb: paire de base

PCR: Polymerase Chain Reaction pHT: Post Hydroxy-Tamoxifen PIC: Pre-Initiation Complex

PI3K: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PGCs: Primary Germ Cells

PML: Promyelocytic Leukemia PN: Pronucleus

PNB: Pre Nucleolar Bodies

Pre-rRNA: Precursor Ribosomal Ribonucleic Acid PSW: Polymerase-Switched State

PTRF: Polymerase I and Transcript Release Factor RPI: RNA polymerase I

RPII: RNA polymerase II RPIII: RNA polymerase III

RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

S. cerevisiae: Saccharomyces Cerevisiae

shRNA: Small Hairpin Ribonucleic Acid siRNA: Small Interfering Ribonucleic Acid SL1: Selectivity Factor 1

SNF2h: Sucrose non fermenting 2 homolog snoRNA: Small Nucleolar Ribonucleic Acid snoRNP: Small Nucleolar Ribonucleoprotein snRNA: Small Nuclear Ribonucleic Acid snRNP: Small Nuclear Ribonucleoprotein SpPr: Spacer Promoter

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TdT: Terminal deoxynucleotidyl transferase TE: Trophectoderm

TET: Ten Eleven Translocation TFIIH: Transcription Factor IIH

TIFIA: Transcription Initiation Factor IA TIP5: TTF-I-interacting protein 5 TOR: Target of Rapamycin Tsp: Spacer Terminator

TTF-I: Transcription Termination Factor I UAF: Upstream Activating Factor UBF: Upstream Binding Factor UCE: Upstream Control Element UV: Ultraviolet

VA1: Viral Associated 1

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor

X. laevis: Xenopus laevis

ZGA: Activation du Génome Zygotique 3C: Chromatin Conformation Capture 4-HT: 4-Hydroxy-Tamoxifen

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Remerciements

J'aimerais en premier lieu remercier mon directeur de recherche Dr Thomas Moss. Je le remercie de m'avoir confié un projet de recherche si intéressant et si important, et que je sais lui tient tant à cœur. Le Dr Tom Moss a toujours été un directeur de recherche extrêmement motivant, très passionné, avec des idées toujours très intéressantes. Ceci, je pense, a vraiment été très important pour mes travaux de recherches effectués dans son laboratoire, et probablement le sera pour ma future carrière scientifique.

J'aimerais également remercier Victor Stefanovsky et Michel Tremblay, qui sont deux professionnels de recherche extrêmement passionnés par ce qu'ils font, et je leur en suis redevable. Je les remercie pour leurs travaux gigantesques qui ont abouti à l'obtention du modèle de l'inactivation du gène Ubf chez la souris. Ils ont toujours été de grand conseil dans mes travaux, ainsi que dans tout le reste d'ailleurs. Je les remercie pour tous les bons moments passés dans le laboratoire. Ça a été un vrai plaisir de travailler dans le département "transcription" du laboratoire avec Victor Stefanovsky et d'apprendre de lui.

Je souhaite également remercier les étudiants avec qui j'ai travaillé directement, comme Frédéric Langlois et Frédéric Lessard. Ça a été très agréable d'apprendre de vous et de travailler à vos côtés. Je remercie Frédéric Lessard pour les bons moments passés dans le laboratoire, pour ses conseils, pour son admiration pour TTF-ARF-B23/NPM, pour ses idées autour du projet UBF, pour nos discussions ainsi que pour les fous rires.

Je souhaite également remercier tous les anciens et actuels membres du laboratoire: Alexandre Mikryukov, Prakash Mishra, Joël Boutin, Chelsea Herdman, Ines Bacher et Jean-Clément Mars. Ça a été très agréable de travailler à vos côtés. Merci pour votre présence et pour les bons moments passés dans le laboratoire, pour les discussions, votre aide et votre sympathie.

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(21)

Chapitre 1: Introduction

1.1 Les gènes d'ARNr

1.1.1 Organisation des gènes d'ARNr

Les gènes d'ARN ribosomal (ARNr) sont organisés en multiples copies qui sont elles-mêmes organisées en tandem. Chez les mammifères, chaque unité de gène d'ARNr d'une longueur d’à peu près 40 kb est constituée d'un segment transcrit d'une longueur d'environ 14 kb codant les ARN 18S, 5.8S et 28S ainsi que d'un segment intergénique (Intergenic Spacer, IGS) non transcrit d’environ 30 kb (Figure 1.1a) (McStay and Grummt, 2008; Moss et al., 2007). Chez la levure, la répétition d’une longueur d’à peu près 9.1 kb contient une séquence transcrite de 6.9 kb et la séquence de l’IGS d’environ 3 kb. Chez les eucaryotes, l'organisation générale des gènes d’ARNr est semblable à l'exception de la levure Saccharomyces Cerevisiae qui possède la séquence codante pour l'ARN 5S au sein de sa séquence intergénique.

Chez la souris, les éléments régulateurs sont situés sur le segment IGS comme suit (Figure 1.1b): élément Spacer Promoter, plusieurs répétitions d'enhancers, un site terminateur To, ainsi que les

éléments promoteurs. Un site de terminaison Tsp est situé en amont du gène et dix sites T1-10 en aval du

gène d’ARNr. Chez les mammifères, les éléments promoteurs consistent en l'élément Core Promoter

Element (CPE) situé à proximité du site d'initiation de la transcription ainsi que d'un élément de contrôle Upstream Control Element (UCE), qui est situé à une centaine de bases du site d'initiation de la

transcription. L'élément CPE est nécessaire pour une initiation spécifique de la transcription alors que l'élément de contrôle UCE augmente l'efficacité de transcription (Comai, 2004). Les plantes, les champignons et les protozoaires possèdent uniquement l’élément CPE (Moss et al., 2007; Moss and Stefanovsky, 1995).

Étant donné leur organisation en répétitions, il est difficile d'obtenir les séquences complètes des gènes d’ARNr par séquençage du génome. La séquence complète d'un clone d'une unité de gène d’ARNr chez l'humain a été publiée (Gonzalez and Sylvester, 1995) et une seconde étude a assemblé la séquence complète d'une unité de gène d’ARNr chez la souris, majoritairement à partir d'un seul clone de Bacterial Artificial Chromosome (BAC) (Grozdanov et al., 2003). Dans les deux cas, l'analyse des séquences révèle la présence de nombreuses répétitions au sein de la séquence IGS. Effectivement, chez la souris, deux blocs de séquence d’une longueur de 7 et 9 kb sont répétés. Également, de multiples répétitions de séquences de 500 pb ou moins, qui inclue de multiples exemplaires de Simple

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Sequence Repeats (SSR), d'éléments transposables de types Long Interspersed Nucleotide Elements

(LINES), Short Interspersed Nucleotide Elements (SINES) et Long Terminal Repeat (LTR).

En plus de contenir les régions régulatrices des gènes d’ARNr, il a été montré que des transcrits qui sont originaires de la région intergénique IGS seraient impliqués dans l'induction de la structure fermée des gènes d’ARNr (Mayer et al., 2008; Mayer et al., 2006) et dans la séquestration de protéines contenant une séquence spécifique appelée Nucleolar Detention Sequence (NoDS) dans le nucléole (Audas et al., 2012).

Figure 1.1: L'organisation des gènes d'ARNr. a) Organisation des gènes d'ARNr chez les mammifères, le Xénope

X. laevis et chez la levure S. cerevisiae. b) Schéma représentant l'organisation des gènes d’ARNr chez la souris.

ITS: Internal Transcribed Spacer, ETS: External Transcribed Spacer. c) Modèle décrivant la topologie des gènes d’ARNr. U: Région en Upstream, P: Promoteur, T: Terminateur. Extraits respectivement de (Moss et al., 2007), (Sanij et Hannan, 2009) et (Denissov et al, 2011).

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Un modèle pour la topologie des gènes d’ARNr a été proposé (Figure 1.1c) (Denissov et al., 2011). Selon ce modèle, les régions promotrices et terminatrices des gènes d’ARNr seraient en contact par l'intermédiaire du facteur d'initiation de la transcription SL1. La région codante de la répétition d’ARNr aurait une organisation cylindrique sur laquelle de multiples ARN polymérases I pourraient se fixer alors que les parties latérales ouvertes de la structure faciliteraient la fixation des facteurs de transcription.

1.1.2 NORs: Nucleolar Organizer Regions

La formation du nucléole résulte de la transcription des gènes d'ARNr qui constituent les Nucleolar

Organizer Regions (NORs). Ces derniers sont situés sur les bras courts des chromosomes

acrocentriques 12, 15, 16, 17, 18 et 19 chez la souris et sur les chromosomes acrocentriques 13, 14, 15, 21 et 22 chez l'humain (Figure 1.2). Dans une cellule diploïde murine ou humaine, environ 400 répétitions de gènes d’ARNr sont contenues sur les dix NORs. Chez la drosophile, une cellule diploïde contient deux NORs, chacun provenant des chromosomes X et Y et contenant chacun environ 200 répétitions d’ARNr (Dimario, 2004).

Figure 1.2: Régions organisatrices du nucléole. a) Localisation des NORs sur le schéma représentant le chromosome 15 humain. b) Représentation du positionnement des NORs sur les cinq chromosomes humains et murins. Extraits de (McStay et Grummt, 2008).

Lorsque les cellules sont en métaphase de la mitose, les NORs peuvent être observés par la technique de Fluorescence In Situ Hybrydization (FISH). Il est généralement considéré que seule une proportion des NORs est active dans une cellule en prolifération, le reste des gènes étant inactifs suite à des modifications épigénétiques les rendant hypercondensés et non permissifs à la transcription (Conconi

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actifs restent hypocondensés (Heliot et al., 1997) par rapport à l'ADN satellite adjacent, après leur analyse par microscopie électronique à l'aide de la procédure TdT-immunogold (Thiry, 1993; Thiry and Daneholt, 1998). Il s'agit de l'analyse de l'incorporation d'un nucléotide marqué sur l'ADN par réaction enzymatique à la Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), couplée à sa détection à l'aide d'un anticorps primaire puis d'un anticorps secondaire couplé à des billes d'or. Le nombre de billes d'or est alors proportionnel à la présence d'ADN et est proportionnel à la compaction de l'ADN. En utilisant cette technique, l'étude a permis de montrer que le locus qui contient les NORs était dix fois moins condensé par rapport à l'ADN satellite adjacent (Heliot et al., 1997). La raison de leur décondensation par rapport au reste du chromosome est probablement attribuable au fait que plusieurs protéines, dont celles qui participent dans l'initiation de la transcription telles que UBF et l'ARN polymérase I, restent fixées sur les NORs en mitose (Figure 1.3) (Roussel et al., 1996; Roussel and Hernandez-Verdun, 1994). La présence de ces protéines qualifiées d'argyrophylic, signifiant qu'elles favorisent la coloration à l'argent, rend possible l'observation des nucléoles en interphase et des NORs en mitose (Roussel and Hernandez-Verdun, 1994; Trere, 2000).

Figure 1.3: UBF reste fixé sur les gènes d’ARNr actifs durant la mitose. Image obtenue après un FISH-3D. Immunolocalisation d'UBF et de l'ADNr lors de a) l'interphase et lors de b) la métaphase de la mitose dans des cellules Hela. Les gènes inactifs sont indiqués par les flèches blanches. Extraits de (McStay et Grummt, 2008).

1.1.3 Épigénétique des gènes d’ARNr

Les cellules murines et humaines contiennent environ 400 répétitions de gènes d’ARNr par cellule diploïde. Des travaux effectués dans des cellules murines ont permis de révéler l'existence de deux

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états épigénétiques des gènes d’ARNr (Conconi et al, 1989). En effet, par une analyse d'accessibilité au psoralène (Figure 1.1.4), il a été décrit qu'à peu près 50% des gènes d’ARNr étaient dans une conformation épigénétique active et que les gènes restant se trouvaient dans une conformation épigénétique inactive. Des analyses de digestion à la nucléase microccocale ont révélé que la portion inactive des gènes d’ARNr était composée d'une chromatine arrangée sous forme de nucléosome, contrairement à la portion des gènes actifs. L'étude a montré que ce ratio de gènes actifs et inactifs était conservé aussi bien en interphase qu'en métaphase de la mitose, où la même étude a décrit que le niveau transcriptionnel de l'ARN polymérase I était six fois plus faible. L'analyse par accessibilité au psoralène chez la levure a permis de révéler le même constat quand à l'existence des deux populations épigénétiques actives et inactives des gènes d’ARNr (Dammann et al., 1993).

Chez les mammifères, les données existantes à ce jour semblent indiquer qu’il existe deux mécanismes d’inactivation des gènes d’ARNr. Un mécanisme dépendant de la méthylation de l’ADNr sur des résidus CpG (Santoro and Grummt, 2001), ainsi qu’un second mécanisme indépendant de la méthylation de l’ADNr sur des résidus CpG et qui n'est pas encore caractérisé à ce jour (Gagnon-Kugler et al., 2009). L’existence de ce second mécanisme parait logique étant donné que la levure S.

cerevisiae ne dispose pas de mécanisme de méthylation d’ADN (Li, 2002) mais possède cependant

deux populations de gènes d’ARNr actifs et inactifs qui sont maintenues malgré les divisions cellulaires (Damman et al, 1993). À ce jour, les mécanismes cellulaires contrôlant le nombre de gènes actifs et inactifs restent inconnus, de même que la nécessité de l’inactivation de certains gènes. Des études effectuées chez la levure S. cerevisiae et chez les plantes ont permis de mieux comprendre les mécanismes d’inactivation des gènes d’ARNr. Ils sembleraient que l’inactivation des gènes d’ARNr soit conservée de la levure aux mammifères, mais que les complexes intervenant dans ce processus soient distincts (McKeown and Shaw, 2009). La section qui suit a pour but de révéler les différents mécanismes d'inactivation des gènes d’ARNr qui interviennent chez la levure et chez les plantes, cela afin de pouvoir mieux comprendre ceux qui interviennent chez les mammifères et qui sont encore énigmatiques.

1.1.3.1 État épigénétique des gènes d’ARNr chez les eucaryotes

Il existe également deux populations de gènes d’ARNr actives et inactives au sein du génome de la levure S. cerevisia (Dammann et al., 1993), mais contrairement aux mammifères, il semblerait que le ratio des gènes actifs et inactifs soit variable en fonction du rythme de croissance de la levure. Une analyse par Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) de la chromatine des gènes d’ARNr a été effectuée chez la levure (Merz et al., 2008b). Cette technique permet d'étudier le profil de fixation d'une protéine sur l'ADN in vivo, après expression de cette protéine fusionnée à la nucléase microccocale et

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après analyse du profil de digestion de l'ADN par Southern Blot (Schmid et al., 2004). Il a été décrit que la chromatine des gènes d’ARNr actifs est caractérisée par une densité faible d'histones (Merz et al., 2008b). Au sein de la même étude et en couplant la technique de ChEC à l'analyse d'accessibilité au psoralène, il a été montré que la population active des gènes d’ARNr est associée au facteur de transcription Hmo1, qui est un possible homologue du facteur de transcription UBF chez la levure (Gadal et al., 2002). Cette observation a été confirmée dans une étude plus récente qui a décrit le rôle d'Hmo1 dans le maintien de l'état épigénétique actif des gènes d’ARNr après le processus de réplication, qui semble établir l'état inactif des gènes d’ARNr en absence de transcription par l'ARN polymérase I (Wittner et al., 2011).

Figure 1.4: Schéma représentant l'analyse de l'état épigénétique de la chromatine des gènes d’ARNr par

crosslink au psoralène chez S. cerevisiae. Sous ultraviolet (UV), les gènes activement transcrits sont accessibles

au psoralène, contrairement aux gènes inactifs ou aux gènes non activement transcrits. Il est représenté en cercle noir les nucléosomes sur les gènes d’ARNr. L'ADN est extrait et analysé par Southern Blot avec une sonde spécifique de l'ADNr. L'incorporation de psoralène induit un retard de migration sur gel. Modifié à partir de (Hamperl et al., 2013).

Une étude a révélé l'implication de l’histone déacétylase Rpd3 dans l’inactivation des gènes d’ARNr, lors du passage de la phase exponentielle de croissance à la phase stationnaire (Sandmeier et al, 2002). D'après l'étude, l'inactivation des gènes d’ARNr est accompagnée par une déacétylation des histones H4 sur les lysines K5 et K12. Ce résultat a été également observé dans une seconde étude où la déacétylation de l'histone H4 sur les lysines K5 et K12 a été observée spécifiquement sur les régions promotrices et codantes des gènes d'ARNr, de manière Rpd3-dépendante et suite à l'activation de la

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voie de signalisation TOR (Tsang et al, 2003). Une étude plus récente a confirmé la déacétylation des même lysines sur la région codante des gènes d’ARNr et a rapporté le rôle des protéines Rpd3 et Spt16 dans l'augmentation de l'assemblage des histones H2B et H4 sur les gènes d’ARNr (Johnson et al., 2013) et ces changements ont été observés sur les gènes d’ARNr lors du passage de la phase exponentielle de croissance à la phase stationnaire. Ces résultats confirment le niveau faible d'histones sur les gènes d’ARNr actifs qui a été observé lors de l'étude décrite précédemment (Merz et al, 2008). Chez les plantes, les mécanismes d’inactivation des gènes d’ARNr ont été décrits lors de l’étude du phénomène de dominance nucléolaire (McStay, 2006; Pikaard, 2000). Il s’agit de l’inactivation des gènes d’ARNr issus de l’un des parents après croisement de deux espèces différentes de plantes. Initialement découvert chez les plantes (Navashin, 1934), c'est grâce à l'analyse d'hybrides issus de croisements entre Xenopus laevis et Xenopus borealis que le phénomène a été élucidé (Blackler and Gecking, 1972; Cassidy and Blackler, 1974). Effectivement, les hybrides issus de ces croisements n'exprimaient pas les gènes d’ARNr des deux parents. C'est alors qu'a été proposé que le phénomène résultait de la transcription préférentielle des gènes d’ARNr de Xenopus laevis et que le terme de dominance nucléolaire a été proposé (Honjo and Reeder, 1973).

Des travaux effectués avec des hybrides de plantes céréalières ont suggéré que le phénomène de dominance nucléolaire résultait de la modification de la chromatine des gènes d’ARNr, et particulièrement que les gènes d’ARNr actifs de l'hybride étaient légèrement hypométhylés contrairement aux gènes inactifs (Flavell et al., 1988; Houchins et al., 1997). Cependant, les études menées chez le Xénope ont suggéré que la méthylation des CpG n’était pas corrélée à l’inactivation des gènes d’ARNr (Macleod and Bird, 1983). L'étude a utilisé le fait que les gènes d’ARNr de spermatozoïdes de Xénope sont fortement méthylés sur 19 résidus CpG de la région du promoteur, comparativement aux cellules somatiques du même organisme. Lorsque l'ADNr des spermatozoïdes et des cellules sanguines de Xenopus laevis ont été injectés dans des ovocytes de Xenopus borealis, l'analyse de leur niveau de transcription a révélé que les gènes d’ARNr des spermatozoïdes ont été transcrits aux mêmes niveaux que ceux provenant des cellules somatiques, tout en maintenant leur niveau de méthylation. Ces résultats indiquent que la méthylation des CpG des gènes d’ARNr n'est pas un mécanisme qui induit leur inactivation.

En utilisant un hybride issu du croisement de deux plantes, il a été rapporté qu'il y avait une corrélation entre l’inactivation des gènes d’ARNr de l’espèce dominée et la méthylation de l’ADN sur les résidus CpG ainsi que les modifications post-traductionnelles sur les histones (Chen and Pikaard, 1997). Dans cette étude, il a été effectué la germination de l'hybride de plante en présence d'un inhibiteur de la

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Trichostatine A (TSA). Il a été rapporté que ces traitements ont entraîné l’expression des gènes d’ARNr

préalablement inactifs de l’espèce dominée, ainsi qu'une augmentation de l'expression des gènes d’ARNr de l'espèce dominante. Cependant, le ratio des gènes actifs et inactifs d’ARNr n'a pas été analysé après utilisation de ces inhibiteurs; on ne sait donc pas dans quelle proportion la méthylation de l'ADN a contribué au phénomène de dominance nucléolaire. En comparant cette étude avec celle effectuée chez Xenopus laevis (Macleod and Bird, 1983) ainsi qu'avec une étude effectuée chez les mammifères (Gagnon-Kugler et al., 2009) qui est présentée plus loin (section 1.1.3.2), on peut conclure que la méthylation sur les CpG est un mécanisme probablement nécessaire au phénomène de dominance nucléolaire mais qu'il n'est pas suffisant à ce dernier.

Dans une étude plus récente, l'identification des modifications épigénétiques qui seraient associées aux gènes d’ARNr actifs et inactifs lors du phénomène de dominance nucléolaire a été rapportée (Lawrence et al., 2004). Il a été décrit que les gènes d’ARNr inactifs étaient enrichis en marques épigénétiques inactives comme la marque H3K9me2, ainsi qu'en l’hyperméthylation de l'ADN de leur région promotrice, alors que les gènes actifs d’ARNr étaient enrichis en marques épigénétiques actives comme la marque H3K4me3 ainsi qu'en l’hypométhylation de l'ADN sur leur région promotrice et qu’ils étaient associés à l’ARN polymérase I. Dans la même étude, il a été révélé l’implication de l’histone déacétylase HDT1 dans le mécanisme d’inactivation des gènes d’ARNr, après analyse de l'effet de la réduction des niveaux protéiques d’HDT1.

Dans une autre étude plus récente, l'implication de l’histone déacétylase HDAC6 dans le mécanisme de dominance nucléolaire a également été montrée (Earley et al., 2006). La réduction des niveaux protéiques d’HDAC6 a conduit à l’hypométhylation de l'ADNr sur les régions promotrices, à l’enrichissement des marques épigénétiques actives de la transcription, ainsi qu'à la perte des marques épigénétiques inactives comme la marque H3K9me2 sur l’ADNr. Dans une étude, il a été proposé que des d’ARN non-codants seraient nécessaires pour induire la méthylation des gènes d’ARNr lors du processus de dominance nucléolaire (Preuss et al., 2008). Il a été rapporté dans cette même étude que la protéine cytosine méthyltransférase Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2) ainsi que les protéines Methyl-CpG-binding domain 6 (MBD6) et MBD10 participeraient dans l’inactivation des gènes d’ARNr.

1.1.3.1 État chromatinien des gènes d’ARNr chez les mammifères

Les expériences d'accessibilité au psoralène ont révélé qu'au sein des cellules murines en culture, environ 40 % des gènes sont actifs et que cette fraction apparaît être en grande partie non affectée par le rythme de croissance ou par la progression dans le cycle cellulaire (Conconi et al., 1989;

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Stefanovsky and Moss, 2006). On ne peut pas affirmer qu'il n'existe pas de circonstances affectant le nombre de gènes d'ARNr actifs chez les mammifères, mais à ce jour il n'existe pas de données fiables pour le démontrer.

Figure 1.5: États chromatiniens des gènes d’ARNr chez les mammifères. La chromatine des gènes d'ARNr existe sous trois états épigénétiques: (1) hétérochromatique, (2) euchromatique et activement transcrite, ainsi que (3) euchromatique et non activement transcrite. Le diamètre de la fibre nucléosomale est indiqué en nm. Modifié à partir de (Sanij e al, 2009).

Les gènes d’ARNr inactifs adoptent un état chromatinien considéré comme constitutivement fermé et cet état épigénétique résulterait d'un processus de compaction à long terme qui serait transmis aux cellules filles après division (Figure 1.5). Les gènes d’ARNr actifs ont été proposés comme pouvant être transcriptionellement compétents ou non, et cet état épigénétique des gènes serait le résultat de la présence ou non des facteurs de l'initiation de la transcription (Chen et al., 2004; Mais et al., 2005; Sanij et al., 2008) ou de modifications épigénétiques dépendantes du contexte cellulaire (Murayama et al., 2008). Plus récemment et à partir de données in vitro, il a été proposé que les gènes d’ARNr actifs et non activement transcrits seraient non méthylés sur leur région du promoteur, associés aux facteurs de l'initiation mais qu'ils adopteraient une configuration nucléosomale défavorisant l'initiation de la transcription (Xie et al., 2012).

D'une manière générale, il existe deux mécanismes d'action pour les modifications épigénétiques de la chromatine: la méthylation de l'ADN et les modifications post-traductionnelles sur les histones (Bernstein et al., 2007; Rivera and Ren, 2013). La méthylation de l'ADN est une modification constitutive, difficilement réversible contrairement aux modifications qui portent sur les histones. Ces modifications font intervenir des complexes de remodelage différents qui sont souvent la cible de dysfonctionnements retrouvés dans plusieurs pathologies comme le cancer (Choi and Lee, 2013; Davis and Brackmann, 2003; Robertson, 2005).

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1.1.3.2 La méthylation de l'ADN chez les mammifères

La méthylation de l'ADN est considérée comme une marque épigénétique associée avec une répression de la transcription (Bernstein et al., 2007). Chez les mammifères, elle se fait sur le carbone en position 5 des cytosines des résidus CpG (5mC) et cette modification est effectuée par les DNA

Methyltransferases (DNMT). Cette modification épigénétique serait conservée malgré le passage de la

fourche de réplication. Il a été identifié récemment que les enzymes Ten Eleven Translocation (TET) sont responsables de la déméthylation de l’ADN. Le processus se ferait par formation d’intermédiaires de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) (Ito et al., 2011; Tahiliani et al., 2009). Le promoteur des gènes d’ARNr murins contient trois sites CpG potentiels. Comme pour les autres gènes, la méthylation des gènes d’ARNr a aussi été corrélée avec leur inactivation (Santoro and Grummt, 2001; Stancheva et al., 1997).

Il a été montré dans une étude in vitro que la méthylation d'un seul résidu CpG, situé sur la séquence du promoteur murin des gènes d'ARNr en position -133 par rapport au site d'initiation de la transcription, inhibait totalement la transcription d’une construction rapporteur qui contenait une copie de gène d’ARNr (Santoro and Grummt, 2001). Par des analyses de DNAse footprinting et de

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), il a été rapporté que cette unique modification empêchait

partiellement la liaison du facteur de transcription UBF, ce qui empêcherait la formation du PIC. Cependant, plusieurs sites CpG situés sur la même région des gènes d’ARNr humains n’ont jamais été rapportés comme ayant la même fonction, malgré leur forte tendance à être méthylés (Gagnon-Kugler et al., 2009).

Il a été proposé que le complexe de remodelage ATP-dépendant Nucleolar Remodeling Complex (NoRC) serait responsable de l'inactivation des gènes d’ARNr. Le complexe NoRC est constitué de

TTF-I-interacting protein 5 (TIP5) et de l'ATPase Sucrose non fermenting 2 homolog (SNF2h) et

possède deux fonctions: le remodelage des nucléosomes et l'induction de l'inactivation de la chromatine des gènes d’ARNr. NoRC permettrait le recrutement des DNMT après son propre recrutement par le facteur de transcription TTF-I Transcription Termination Factor I (TTF-I) sur les gènes d’ARNr (Nemeth et al., 2004). Il a aussi été rapporté que lorsque TTF-I se liait à son site terminateur To proche des éléments promoteurs, TTF-I pourrait soit induire un remodelage des

nucléosomes après liaison de la protéine Cockayne Syndrome Protein B (CSB), cela afin de permettre la fixation du PIC (Yuan et al., 2007), soit recruter le complexe NoRC pour induire l'inactivation des gènes d’ARNr (Figure 1.6) (Nemeth et al., 2004). TIP5 interagit avec la protéine Histone Deacetylase 1

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(HDAC1) ainsi qu'avec les DNMT1 et DNMT3b et il a été rapporté que c'est par son biais que les régions d'ADNr sont ciblées pour l'hétérochromatinisation (Zhou and Grummt, 2005; Zhou et al., 2002).

Figure 1.6: Représentation du modèle de la régulation de l'état épigénétique des gènes d’ARNr par CSB et NoRC. TTF-I lié à son site To (représenté par un rectangle rouge) interagit avec CSB ou TIP5, ce qui permet de

recruter G9a ou NoRC sur les gènes d’ARNr. L'équilibre entre la fixation de CSB ou NoRC déterminerait le ratio du nombre de gènes actifs (en bleu) et du nombre de gènes inactifs (en orange), respectivement. Une fois établi en 5' de la répétition d'ADNr, l'état épigénétique établi se propagerait sur toute la répétition d'ADNr par un mécanisme inconnu. Extrait de (McStay et Grummt, 2008).

Plus récemment, des ARN non-codants Promoter-associated RNA (pRNA) provenant de la transcription de la région du Spacer Promoter ont été identifiés et il a été rapporté que ces ARN seraient nécessaires à la localisation nucléolaire du complexe de remodelage NoRC (Santoro et al., 2010). Également, il a été proposé que ces ARN non-codants formeraient un complexe ADN/ARN au site terminateur To, ce qui permettrait de recruter la protéine DNMT3b aux gènes d’ARNr afin d'induire

leur inactivation (Schmitz et al., 2010).

Une étude qui a porté sur l'analyse de l'effet de la perte de méthylation de l'ADNr dans des cellules HCT116 humaines qui sont mutées pour les gènes Dnmt1 et Dnmt2 (Dnmt1-/- Dnmt2-/-) a révélé des résultats inattendus (Gagnon-Kugler et al., 2009). Ces travaux ont montré que la perte de méthylation de l’ADNr n’a eu qu’un effet mineur sur le ratio de gènes actifs et inactifs. Ces résultats démontrent que la méthylation des résidus CpG n’est pas le seul mécanisme par lequel les gènes d’ARNr peuvent êtres inactivés. Ces résultats coïncident avec ceux obtenus dans des études effectuées chez la plante (section 1.1.3.1.) et sont en accord avec le maintien d'un ratio de gènes d'ARNr actifs/inactifs en absence de méthylation de l'ADN chez la levure (Li, 2002). Cependant, il a été observé dans cette étude que les cellules Dnmt1-/- Dnmt2-/- avaient un rythme de prolifération très bas par rapport aux cellules contrôles. Il a également été observé que ces cellules avaient un taux de synthèse d'ARNr très diminué. Originalement, cet effet a été attribué à l’activation du suppresseur de tumeur ARF dans ces

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avéré que cet effet était attribuable à une transcription des gènes d'ARNr par l'ARN polymérase II ainsi qu'à un défaut dans la maturation des ARN ribosomaux dans ces cellules. Il a été démontré que ces ARNr transcrits par l'ARN polymérase II s'accumulaient et interféraient avec la maturation de l’ARNr normalement transcrit par l'ARN polymérase I. Également, il a été rapporté que ces mêmes transcrits induisaient une instabilité génomique aux locus d'ADNr.

1.1.3.3 Les modifications post-traductionnelles des histones chez les mammifères

Les histones subissent des modifications post-traductionnelles comme l'acétylation, la méthylation, la phosphorylation et l'ubiquitination (Figure 1.7) (Kouzarides, 2007). L'acétylation des histones est une marque épigénétique considérée comme activatrice de la transcription. Cette modification est effectuée sur les lysines par les protéines Histones Acetyl Transferases (HAT) et peut être retirée par les

Histones Deacetylases (HDAC). Les lysines ont une charge positive qui leurs permettent d'avoir une

bonne affinité avec l'ADN qui est chargé négativement. L'acétylation des lysines supprime cette charge positive et diminue l'affinité du complexe histone-ADN, ce qui permet l'ouverture de la chromatine condensée et donc l'accessibilité aux facteurs de transcription. De ce fait, l'actétylation sur les histones H3 et H4 est généralement considérée comme une marque épigénétique activatrice de la transcription (Figure 1.7) (Li et al., 2007).

Figure 1.7: Modifications post-traductionnelles majeures des histones et leur rôle biologique. Les acides aminés qui sont ciblés par les modifications sont représentés entre parenthèses. Extrait de (Jayani et al, 2010).

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La méthylation des histones est effectuée par les protéines Histones Methyl Transferase (HMT) et peut être une marque épigénétique active ou inactive de la transcription, dépendamment des lysines ou des arginines modifiées ainsi que du niveau de méthylation (Figure 1.7) (Jayani et al., 2010; Li et al., 2007). La mono-, di- et triméthylation sur les lysines 9 de l'histone H3 H3K9men sont des marques répressives

de la transcription, de même que la méthylation des lysines 27 de l'histone H3 H3K27me (Martin and Zhang, 2005). La méthylation peut être une marque épigénétique active, comme par exemple la di- et triméthylation de la lysine 4 ainsi que la méthylation des lysines K36, K79 de l'histone H4 (Martin and Zhang, 2005).

Les deux mécanismes de remodelage de la chromatine influeraient l'un sur l'autre (Bernstein et al., 2007). Les complexes qui entraînent la méthylation de l'ADN seraient recrutés par des protéines qui reconnaissent les marques post-traductionnelles répressives des histones comme la marque

H3K9me3. De manière réciproque, le recrutement des complexes de méthylation sur l'ADN entraînerait

une déacétylation des histones environnants, ce qui aurait pour conséquence d'induire un état répressif de l'initiation de la transcription.

1.1.3.4 Fonctions des copies en extra des gènes d’ARNr

Chez la levure, il a été proposé que les gènes d’ARNr inactifs serviraient de réserves de séquences pour la réparation d'ADN lorsque des dommages sur l'ADNr se produisent (Kobayashi, 2008). D’autres études ont proposé que l'ADNr servirait de senseur pour l'instabilité génomique et que l'ADNr activerait les mécanismes de réparation de l'ADN ou de l'apoptose pour préserver le reste du génome (Kobayashi, 2008; Shaw and McKeown, 2011). Un mécanisme complexe régulerait le nombre de copies de gènes d’ARNr inactifs. Ce mécanisme semble être critique pour la cellule puisque la diminution du nombre de gènes inactifs chez la levure a montré une sensibilité accrue aux dommages à l'ADN (Ide et al., 2010), ce qui signifie qu'une transcription abusive serait toxique pour la cellule. D'autres études ont montré que des recombinaisons au locus d'ADNr affectent la stabilité des gènes d’ARNr et que cela moduleraient la durée de vie et le vieillissement chez la levure (Ganley et al., 2009). L'étude (Gagnon-Kugler et al., 2009) (section 1.1.3.2.) qui a été effectuée chez les mammifères a également révélé un taux de recombinaison élevé au sein des cellules Dnmt1-/- Dnmt2-/-. Il faut comprendre que la méthylation des gènes d’ARNr et leur inactivation sont des processus complexes qui peuvent avoir des effets drastiques lors de leur altération. Cette étude a montré que du fait de leur organisation en répétitions, la compaction des gènes d’ARNr chez les mammifères comme chez la levure est essentielle non seulement pour un assemblage des ribosomes mais aussi pour assurer leur

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stabilité génomique. Effectivement, la compaction des gènes protège les répétitions des mécanismes de recombinaison et permet d'avoir une certaine réserve de gènes mosaïques en cas de mutations.

1.2 Le nucléole

Le nucléole est un sous compartiment nucléaire composé d'ARN et de protéines. Lorsque le nucléole est observé par microscopie, le nucléole paraît plus dense aux électrons par rapport au reste du noyau (Figure 1.8). La morphologie de ce compartiment reflète l'activité de transcription des gènes d'ARNr et sa morphologie a longtemps été utilisée comme un marqueur des cellules tumorales (Guttman et Halperm, 1935; Derenzini et al., 2000) . Des cellules en croissance se distinguent aisément par de larges et multiples nucléoles de formes réticulés, alors que des cellules en différenciation ou qui subissent un stress sont caractérisées par des nucléoles moins nombreux par cellule et de formes sphériques (Popp et Wachtler, 1983; Sirri et al., 2008). On a attribué au nucléole un rôle majeur dans la réaction au stress cellulaire étant donné ses multiples implications dans les grands processus cellulaires comme le cycle cellulaire, la régulation des suppresseurs de tumeurs, la réparation d'ADN, la sénescence et le vieillissement (Boisvert et al., 2007; Boulon et al., 2010; Hein et al., 2013). Des études révèlent que l'intégrité structurale du nucléole dans les cellules cancéreuses constituerait une cible pour une stratégie de traitement du cancer (Drygin et al., 2014; Hein et al., 2013; Quin et al., 2014). Il a été montré dans des études récentes que le dysfonctionnement du nucléole serait impliqué dans les maladies de Huntington et de Parkinson (Lee et al., 2014; Parlato and Liss, 2014; Rieker et al., 2011).

1.2.1 Le nucléole, site de "fabrication" des ribosomes

Le nucléole est décrit comme le compartiment nucléaire où se déroule la biogenèse des ribosomes. La biogenèse comprend: la transcription des gènes d'ARNr par l'ARN polymérase I, les modifications post-transcriptionnelles de l'ARNr, la maturation de l'ARNr, l'incorporation de l'ARN 5S et des protéines ribosomales aux particules de pré-ribosomes ainsi que l'export des particules pré-ribosomales vers le cytoplasme. La maturation du pré-ARNr et son assemblage en sous-unités ribosomales ferait intervenir environ 170 protéines, qui incluent des ribonucléases, des hélicases, des chaperonnes, des facteurs d'assemblage et autant de complexes ribonucléoprotéiques Small Nucleolar Ribonucleoprotein (snoRNP) (Fromont-Racine et al., 2003). Il a été proposé que chaque étape de la biogenèse ribosomale serait effectuée dans un sous-compartiment du nucléole. Le nucléole comprend le Fibrillar

Center (FC), le Dense Fibrillar Component (DFC) et le Granular Component (GC) (Figure 1.8). La

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maturation s'effectuerait dans la région du DFC et l'assemblage des particules de pré-ribosomes se ferait au sein du GC.

Figure 1.8: L'organisation du nucléole. a) Image de cellules Hela obtenue par microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) et schéma représentant la structure en trois parties du nucléole. b) Image par microscopie à fluorescence révélant les trois compartiments du nucléole. Le compartiment du FC est représenté après l'immunolocalisation d'UBF, le compartiment du DFC est représenté après l'immunolocalisation de Nop58 et le compartiment du GC est représenté après l'immunolocalisation de NPM1/B23. Extraits de (Boulon et al, 2010).

1.2.1.1 Transcription et maturation de l'ARNr

La biogenèse des ribosomes nécessite la transcription par les trois ARN polymérases. La transcription des gènes d’ARNr s'effectue au sein du nucléole par l'ARN polymérase I et donne naissance à des structures visualisables par microscopie électronique, les Millers spreads ou Christmas trees (Raska, 2003). Chez la levure, il a été estimé que l'ARNr compterait pour 80% de l'ARN total dans une cellule en prolifération (Warner, 1999). L'ARN 5S est transcrit par l'ARN polymérase III au sein du noyau et est acheminé au nucléole par les snoRNP. Les gènes qui codent pour les protéines ribosomales sont transcrits par l'ARN polymérase II au sein du noyau. La biogenèse des ribosomes est un processus très énergivore pour la cellule et c’est la raison pour laquelle il est communément pensé que la biogenèse ribosomale nécessite une régulation spatio-temporelle pour coordonner la synthèse des ARNr, de l'ARN 5S et des protéines ribosomales.

L’assemblage de la particule pré-ribosomale et la maturation de l’ARNr précurseur 47S commence de manière co-transcriptionnelle (Granneman and Baserga, 2005). Pendant la maturation, l'ARNr 47S subit des modifications post-transcriptionnelles ainsi que des clivages nucléolytiques successifs

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donnant naissance à différents intermédiaires d'ARN (Figure 1.9). Environ 200 modifications post-transcriptionnelles consistent en des méthylations sur les bases et les riboses ainsi qu'en des pseudouridylations (Nazar, 2004). Les clivages nucléolytiques sont effectués par des endonucléases et des exonucléases (Mullineux and Lafontaine, 2012). Les enzymes responsables de la méthylation et des clivages de l'ARNr sont guidées par des Small Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) et leurs facteurs associés. Les snoRNA s'assemblent sous forme de complexes snoRNP avec des protéines nucléolaires comme Fibrillarine (FIB) et guident les enzymes aux sites de modification. Les endonucléases et exonucléases permettent de cliver les séquences: External Transcribed Spacer (ETS) 5', ETS3', Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 et ITS2, pour finalement donner les ARN matures 18S, 5.8S et 28S. Chez les mammifères, il existe une certaine conservation dans l'ordre des clivages ainsi que dans les sites de modifications post-transcriptionnelles de l'ARNr.

Figure 1.9: Modèle représentant la maturation de l'ARNr et l'assemblage des ribosomes matures chez l'humain. Deux voies sont possibles pour la maturation de l'ARNr. Les voies A et B permettent d'initier la maturation avec, respectivement la coupure au site 1 ou 2 de l'ARNr. Il est représenté l'association des protéines qui interviennent dans la biogenèse des ribosomes (représentées en rouge), l'association des complexes ribonucléoprotéiques (représentés en jaune) ainsi que l'association des protéines ribosomales (représentées en bleu) au fur et à mesure du processus. Extrait de (Freed et al., 2010).

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1.2.1.2 Assemblage des ribosomes

Il a été rapporté que des protéines ribosomales et des Small Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) s'assembleraient de manière co-transcriptionelle au ARNr naissant pour former une particule pré-ribosomale (Granneman and Baserga, 2005; Henras et al., 2008). Une fois la transcription complète, le reste des protéines ribosomales et l'ARN 5S ainsi que des protéines non-ribosomales s'associeraient au complexe pour former la particule pré-ribosomale nucléolaire 80-90S (Tschochner and Hurt, 2003a). L'ARNr subirait les premières étapes de maturation et une séparation du complexe 80-90S donnerait naissance aux sous-unités nucléaires pré-40S et pré-60S du ribosomes. Après les dernières étapes de maturation, les ARN matures 18S, 5S, 5.8S et 28S ainsi que des protéines ribosomales formeraient les sous-unité 40S et 60S matures du ribosome au sein du cytoplasme.

1.2.2 Constitution du nucléole

La structure du nucléole s'organise autour des NORs et résulte de la transcription par l'ARN polymérase I. À l’aide d’études par imagerie cellulaire en temps réel, il a été rapporté que les protéines impliquées dans la biogenèse ribosomale seraient en constant échanges entre le nucléole et le nucléoplasme (Chen and Huang, 2001). Initialement, la purification des complexes de pré-ribosomes couplée à une analyse par spectrométrie de masse a permis d'identifier de nombreuses protéines qui interviennent dans la biogenèse ribosomale chez la levure (Bassler et al., 2001; Grandi et al., 2002; Harnpicharnchai et al., 2001). La construction de librairies afin de créer des protéines fusionnées à la GFP et d'identifier leur localisation a également permis d'identifier de nombreuse protéines nucléolaires chez la levure (Huh et al., 2003).

Par des analyses de protéomique du nucléole, près de 6000 protéines différentes chez l'humain et 200 protéines chez la plante Arabidopsis Thaliana ont été découvertes (Figure 1.10b) (Boisvert et al., 2011). Les études qui ont porté sur la caractérisation du protéome nucléolaire humain ont permis d'identifier de nombreuses protéines nucléolaires qui ont initialement découvertes chez la levure (Andersen et al., 2005; Andersen et al., 2002). D'autres études ont suggéré que la constitution du protéome nucléolaire changerait après un stress comme lors de dommages à l'ADN (Boisvert et al., 2010) ou après une infection virale (Lam et al., 2010). Ce qui révèle la complexité d'un tel compartiment dont la composition protéique et la structure changent en réaction à différents stimuli. La morphologie des nucléoles est communément utilisée comme indicateur du niveau de production des ribosomes et de ce fait, du contexte de croissance cellulaire. Raison pour laquelle la structure des nucléoles est utilisée comme un marqueur de tumorigenèse (Derenzini et al., 2000). Une cellule en prolifération est

Figure

Figure 1.1: L'organisation des gènes d'ARNr. a) Organisation des gènes d'ARNr chez les mammifères, le Xénope  X
Figure  1.2:  Régions  organisatrices  du  nucléole.  a)  Localisation  des  NORs  sur  le  schéma  représentant  le  chromosome 15 humain
Figure  1.3:  UBF  reste  fixé  sur  les  gènes  d’ARNr  actifs  durant  la  mitose.  Image  obtenue  après  un  FISH-3D
Figure 1.5: États chromatiniens des gènes d’ARNr chez les mammifères. La chromatine des gènes d'ARNr existe  sous trois états épigénétiques: (1) hétérochromatique, (2) euchromatique et activement transcrite, ainsi que (3)  euchromatique et non activement t
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