Typage moléculaire par amplification des séquences microsatellites (GACA) 4 , (GTG) 5 et

L’analyse des profils de migration de chaque micro ou minisatellite a permis d’observer des polymorphismes de séquences (figures 34, 35, 36).

Bandes à 500pb Bandes à 220pb 1000pb 500pb 400pb 300pb 200pb

Figure 34: Quelques profils de migration sur gel haute résolution après amplification des

séquences microsatellites (GACA)4 des isolats de C. neoformans. M est le marqueur de poids moléculaire, la bande A à approximativement 600pb est absente chez les isolats du patient CM019 (CM019A à CM019M). A 3000pb 1500pb 1000pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb

Figure 35: Quelques profils de migration sur gel haute résolution après amplification des

séquences microsatellites (GTG)5 des isolats de C. neoformans. M est le marqueur de poids moléculaire. Les bandes A et B sont présentes sur les isolats CM008A-CM008M et CM011A-CM011M ; elles sont par contre absentes sur les isolats CM009A-CM009M et CM010A-CM010M. La bande C n’est présente que chez les isolats CM011A-CM011M.

3000pb 1500pb 1000pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb A B C

Figure 36: Quelques profils de migration sur gel haute résolution après amplification des

séquences minisatellite M13 des isolats de C. neoformans. M est le marqueur de poids moléculaire. Les bandes A et B sont présentes sur les isolats CM013A-CM013M et CM014A-CM014M; elles sont par contre absentes sur les isolats CM012A-CM012M et CM015A-CM015E. Le dendrogramme de la figure 37 a été construit avec un pourcentage de similitude de 95%, il permet de ressortir 15 types moléculaires différents à partir de l’analyse des 150 isolats. Trois types moléculaires sont majoritaires. Six/vingt-cinq (24%) patients sont infectés par deux souches différentes. En effet, les isolats 4 et 5 (CM007D et CM007E) du patient CM007 présentent un profil différent des autres isolats et du prélèvement initial. Le prélèvement initial du patient CM008 (CM008M) présente un type moléculaire différent de celui des autres isolats du même patient qui eux présentent un même type moléculaire. Le prélèvement initial CM025M se retrouve dans un type moléculaire différent de celui des colonies. Les isolats 1 et 3 (CM003A et CM003C) du patient CM003 se retrouvent dans un type moléculaire différent de celui des autres isolats. Les isolats CM015A et CM015B appartiennent à un type moléculaire différent de celui des autres isolats du même patient CM015. Les isolats CM020A et CM021A forment un type moléculaire qui est différent de celui des autres isolats issus du même patient.

A B 3000pb 1500pb 1000pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb

Figure 37 : Dendrogramme de la diversité génétique de C. neoformans obtenu par analyse des

I.2.4. Discussion

Les 150 isolats issus de 25 patients testés dans ce travail sont tous sérotype A. Ces résultats sont en accord avec l’étude précédemment menée par Bertout et al., (2012) sur 114 isolats issus de 19 patients, et montre que C. neoformans var. grubii serotype A est le seul sérotype de

C. neoformans impliqué dans la cryptococcose neuro-méningée chez les patients VIH positifs à

l’Hôpital Central de Yaoundé. Plusieurs études démontrent d’ailleurs que ce sérotype est le plus répandu dans le monde et particulièrement en Afrique subsaharienne (Cogliati, 2013 ;

Enache-Angoulvant et al., 2007 ; Casadeval et Perfect, 1999). Il est également le plus impliqué dans la

cryptococcose neuro-méningée, particulièrement chez les patients ayant le SIDA (

Enache-Angoulvant et al., 2007 ; Ito-Kuwa et al., 2007 ; Litvintseva et al., 2005). Le sérotypage de C. neoformans a pendant longtemps été réalisé par des techniques sérologiques (kit Crypto Check)

ou par la combinaison du milieu canavanine-glycine-bromothymol (CGB) bleu et la technique d’immunofluorescence directe (Carvalho et al., 2007 ; Dromer et al., 1993). C’est d’ailleurs cette approche qui fut la première utilisée pour l’identification des sérotypes de C.

neoformans. Cependant, la découverte des mutants non capsulés (Jin et al., 2013 ; O'Meara et

al., 2013) associée à l’arrêt de la production du kit Crypto Check (Ito-Kuwa et al., 2007) a

poussé à la recherche de nouvelles approches de sérotypage de C. neoformans. Plusieurs approches moléculaires ont été proposées, parmi lesquelles la PCR multiplex amplifiant les gènes de la laccase (LAC1) et de la capsule (CAP64). Cette approche permet de différentier dans une PCR unique les 5 sérotypes du complexe C. neoformans/C. gattii (Ito-Kuwa et al., 2007). L’étude des génotypes des isolats par la PCR-RFLP du gène URA5 montre que tous les isolats sont de type VNI. En effet, plusieurs études montrent que la majorité des souches de C.

neoformans var. grubii serotype A sont de type moléculaire VNI et que très peu sont de type

moléculaire VNII (Cogliati, 2013 ; Bertout et al., 2012 ; Feng et al., 2008 ; Escandón et al.,

2006 ; Litvintseva et al., 2006 ; Meyer et al., 2003 ;Meyer et al., 1999). Trilles et al. (2012) ont

récemment montré qu’il existe une relation entre la sensibilité aux antifongiques et les génotypes, mettant de l’emphase sur la détermination de ceux-ci pour une meilleure lutte contre les infections à Cryptococcus.

L’étude du typage moléculaire du complexe C. neoformans/C. gattii est essentiellement réalisée par l’analyse des séquences mini- et microsatellites. L’analyse de ces séquences microsatellites

a permis de grouper les souches dans les principaux types moléculaires connus VN et VG (Cogliati, 2013 ; Ribeiro et Ngamskulrungroj, 2008 ; Trilles et al., 2008 ; Litvintseva et al.,

2006 ; Igraja et al., 2004 ; Meyer et al., 2003 ; Meyer et al., 1999). Cependant, très peu

d’études se sont focalisées sur la diversité génétique pouvant survenir dans une population de sérotype précis d’une part et en combinant les analyses des séquences microsatellites d’autres parts. Les auteurs qui s’y sont engagés ont montré une diversité génétique importante au sein d’un génotype VN/VG précis (Cogliati et al., 2013 ; Bertout et al., 2012 ; Illnait-Zaragozi et al.,

2010 ; Escandon et al., 2006). Dans ce travail, l’usage des microsatellites (GACA)4, (GTG)5 et minisatellite M13 a permis de découvrir une diversité génétique importante au sein de la population de C. neoformans var. grubii sérotype A étudiée. En effet, 15 types moléculaires différents ont été obtenus. Cet important polymorphisme génétique des séquences microsatellites a déjà été obtenu par Bertout et al. (2012) et a également été démontré comme existant chez Aspergillus et Candida (Nébavi et al., 2006 ; Bertout et al., 2001). En utilisant la MLST, Cogliati et al. (2013) ont trouvé 16 génotypes chez C. neoformans var. grubii sérotype A en Italie à partir de 53 isolats. L’analyse de 9 séquences microsatellites chez C. neoformans var.

grubii sérotype A par Illnait-Zaragozi et al. (2010) a permis de générer 14 types moléculaires

différents à partir de 19 isolats au Cuba. L’analyse de la diversité génétique au sein d’un même patient montre que 24% des patients sont infectés par deux souches de génotypes différents. Cette diversité intra patient a aussi été démontrée par Bertout et al. (2012). Desnos-Ollivier

et al. (2010) ont trouvé 20% d’infections mixtes au cours de la cryptococcose neuro-méningée.

Cette variabilité génétique intra-individuelle serait due à des microévolutions de la souche originale ou à une infection chez le même patient par deux souches différentes (Desnos-Ollivier

et al., 2010) et la détermination de cette diversité trouverait son application dans une

éventuelle différence de sensibilité aux antifongiques entre les différentes souches chez le même patient.