Diagnostic biologique des candidoses muqueuses

Le diagnostic mycologique consiste à prélever le produit biologique, à réaliser un examen direct, à mettre le prélèvement en culture sur milieu spécifique et enfin identifier l’agent fongique en cause (Rispail, 2008). La distinction entre colonisation et infection est difficile sur le plan purement biologique. Le caractère commensal de ces levures rend la confrontation aux symptômes cliniques nécessaires (Fournier, 2011).

Ø Prélèvement et transport

Le prélèvement doit être effectué avant tout traitement antifongique, le matériel utilisé obligatoirement stérile (Fathallah et al., 2008).

Dans le cadre des candidoses bucco-pharyngées, les prélèvements sont effectués soit par écouvillonnage, soit par gargarisme à l’aide d’eau physiologique (Gabler et al., 2008 ;

Coignard-Chatain et al., 1998). Les leucorrhées vaginales sont prélevées par écouvillonnage du cul de sac

vaginal après pose d’un spéculum stérile et non humidifié. Les urines sont prélevées dans un pot stérile après asepsie de l’orifice urinaire. Les selles sont prélevées dans un pot stérile en prenant soin de privilégier les sites glaireux ou sanguinolents (Rispail, 2008).

Ø Examen direct

L’examen direct est le test de première ligne. Il permet une orientation diagnostic rapide du genre. Il est peu couteux, spécifique mais reste peu sensible.

L’examen direct à l’état frais consiste à observer au microscope entre lame et lamelle une émulsion du prélèvement sur une goutte d’eau physiologique additionnée de bleu de méthyle. Les levures apparaissent sous forme d’éléments ovalaires, ovoïdes ou allongés à paroi mince de 6 à 8µm, éventuellement bourgeonnantes de 3 à 5µm de diamètre aux extrémités arrondies et quelquefois les pseudofilaments (Fournier, 2011).

En pratique, différentes techniques et colorations spécifiques peuvent être mises en œuvre, rendant alors l’observation plus aisée. Les colorations sont les suivantes :

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Le noir chlorazol qui colore la paroi des éléments mycéliens en vert ;

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Le bleu de méthyle : colorant les éléments mycéliens en bleu ;

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La coloration de Gram : coloration utilisée en bactériologie, elle colore les éléments fongiques donnant ainsi une coloration bleu foncé ;

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Le May-Grunwald-Giemsa (MGG)

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L’usage des composés fluorescents (Fournier, 2011).

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La coloration de Musto (coloration de Gomori-Grocott modifié) est une

Le milieu d’isolement de référence utilisé est la gélose de Sabouraud additionnée d’antibiotiques. Il contient les éléments nécessaires à la croissance de la majorité des champignons : matières azotées (peptone à 10%), un sucre (glucose à 2%), des traces de vitamines (vitamines du groupe B). Les antibiotiques antibactériens utilisés peuvent être soit de la pénicilline G à 5000U/ml et de la Streptomycine à 0,5mg/ml, soit du Chloramphénicol à 0,5 mg/ml et/ou de la gentamycine 0,5 mg/ml (Symms, 2007).

Figure 9: Colonie du genre Candida sur gélose Sabouraud (Symms, 2007)

L’ensemencement débute par un dépôt du produit biologique à la surface du milieu de culture. Les milieux ensemencés sont incubés à 37°C à l’étuve pendant 24 à 48 heures. Pour les levures du genre Candida, l’on observe des colonies blanches, crémeuses (Rispail, 2008).

Les résultats prennent en compte l’examen direct et de la culture :

- Pour l’examen direct : présence de levures et/ou de pseudomycélium ;

- Pour la culture, il faut quantifier les champignons présents dans le milieu de culture en tenant compte de la notion de seuil (différent selon l’origine du prélèvement).

Les renseignements cliniques du patient ainsi que les facteurs de risques sont nécessaires à l’interprétation des examens biologiques comme par exemple l’âge (nouveau-né, nourrisson, vieillards) ; les pathologies sous-jacentes (diabète, immunodépression, SIDA), les antécédents médicaux (explorations fonctionnelles, cathéters, maladies nosocomiales) ou encore les antécédents thérapeutiques (antibiothérapie, corticothérapie).

Ø Identification

L’identification se fait sur la base des caractères morphologiques (macroscopique et microscopique), des tests biochimiques, immuno-sérologiques et plus récemment par les techniques de biologie moléculaire et la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Elle doit

désormais tenir compte de l’éventualité de l’association de deux, trois, voire quatre espèces de levure ou plus dans un même échantillon biologique (Rispail, 2008).

Les milieux chromogènes permettent simultanément la détection des associations d’espèces différentes dans un même échantillon biologique et une identification présomptive de certaines levures du genre Candida (Rispail, 2008).

· Identification phénotypique

L’utilisation des caractères phénotypiques en milieux spécifiques permet une identification présomptive. On peut ainsi citer le test de filamentation en sérum, la recherche des chlamydospores sur milieux pauvres en sucres et contenant un tensioactif (Anane et Khalfallah,

2006 ; Fotedar et Al Hedaithy, 2003).

L’étude de la croissance à 42-45°C après 24 à 48 heures d’incubation sur certains milieux (Sabouraud dextrose agar, Yeast peptone dextrose, Emmon’s modified Sabouraud glucose agar) permet de distinguer les isolats de C. dubliniensis et C. africana qui ne poussent pas de ceux de

C. albicans qui poussent (Romeo and Criseo, 2009).

· Identification biochimique

Les tests biochimiques permettent de mettre en évidence la capacité que possède une levure placée en aérobiose d’assimiler (auxanogramme) ou de fermenter en anaérobiose (zymogramme) les sucres. D’autres caractères peuvent également être recherchés tels que l’activité enzymatique, le test de sensibilité à l’actidione, le test à l’esculine et la recherche de l’uréase (Fathallah et al., 2008). Ces tests sont explorés de nos jours grâce à des minigaleries permettant une approche beaucoup plus précise et simple. Les galeries de références sont : la galerie ID 32C BioMérieux et la galerie API 20C AUX BioMérieux. Il existe d’autres galeries commercialisées telles que : Auxacolor 2 (Bio-RaD), Fungichrom, Fungifast, API Candida (Fathallah et al, 2008). Les levures d’intérêt médical possèdent des caractères biochimiques connus (tableau 5).

Tableau 5 : Caractères morphologiques et physiologiques des principales levures d’intérêt

médical (Hakim et al., 2013).

· Identification sérologique, moléculaire et protéomique

Les tests immuno-sérologiques utilisés en mycologie sont des tests complémentaires pour le diagnostic. La détection d’antigènes repose sur des tests d’identification simples et rapides (5 à 20 minutes) basés sur les techniques d’agglutination de particules de latex utilisant les anticorps monoclonaux spécifiques de l’espèce (Rispail, 2008). On peut citer:

- Bichro-latex albicans Fumouze pour C. albicans; - Bichro-Dubli Fumouze pour C. dubliniensis ; - Krusei-color Fumouze pour C. krusei.

D’autres techniques le plus souvent utilisées pour la recherche d’anticorps spécifiques sont : les réactions d’hémagglutination, d’immunofluorescence indirecte, les réactions immuno-enzymatique de type ELISA et de précipitation telle que l’immunoélectrophorèse (Rispail,

2008).

Les méthodes de biologie moléculaire ont une spécificité parfaite et assurent une identification formelle (Ellepola et al., 2003). L’identification par spectrométrie de masse MALDI-ToF qui identifie les espèces sur la base des spectres atomiques des protéines est de plus en plus utilisée de nos jours car donne des résultats rapides avec une très grande spécificité (Bizzini et

Dans le document Diversité génétique d'isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH positifs à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes (Page 71-76)