Chapitre 2 : Matériel et méthodes
IV. Etude de la sensibilité des isolats fongiques aux extraits de plantes
IV.3. Screening initial d’activité antifongique des extraits bruts
Principe : La dilution en milieu liquide consiste à incorporer l’extrait à tester au milieu de
culture avant de le couler dans les boîtes de Pétri. Après inoculation et incubation, la croissance microbienne est mesurée et, en comparaison avec une boîte témoin, l’effet de l’extrait est évalué en calculant le pourcentage d’inhibition (Therese et al., 2006 ; Moulari, 2005).
Technique :
Ø Les isolats utilisés ont été sélectionnés des isolats issus de l’étude épidémiologique du fait de leur fréquence dans les isolements et de leur sensibilité réduite aux antifongiques testés. Il s’agit de : Candida albicans 194B, Candida glabrata 44B,
Candida parapsilosis 56B et Cryptococcus neoformans CM003 et une souche de
référence Candida albicans ATCC 37037. Ces souches sont ensemencées sur gélose Sabouraud (Oxoid, UK) 48 heures avant la manipulation et incubées à 37°C.
Ø Les suspensions de levures utilisées pour les tests de sensibilité sont préparées à 2.104 Cellules/ml à partir des cultures de 48 heures, par dénombrement direct au microscope optique, via un hématimètre de Malassez. En effet, une öse de la culture jeune est introduite dans 5ml d’eau physiologique stérile, homogénéisée et comptée au microscope pour en déterminer la charge initiale. A partir de cet inoculum mère, une dilution est effectuée de manière à avoir une suspension de concentration 2.104 cellules/ml.
Ø Un gramme (1g) de chaque extrait brut est introduit dans un flacon étiqueté ; le volume est complété à 5ml avec du dimethylsulfoxide (DMSO) à 10% pour les extraits éthanoliques et hydroéthanoliques ou de l’eau distillée pour les extraits aqueux. La solution est homogénéisée au vortex jusqu’à dissolution complète de l’extrait. Cette
Ø Le milieu de culture, Mueller Hinton Agar (Oxoid, UK) est préalablement préparé d’après les consignes du fabriquant et stérilisé à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes et maintenu en surfusion à 45°C dans le bain marie.
Ø Douze ml de ce milieu sont successivement introduits dans des tubes à essai à vis stériles, 3ml d’un seul extrait sont ajoutés par tube, homogénéisés instantanément puis coulés dans une boîte de Pétri identifiée de 90mm et laissés pour solidification. La concentration d’un extrait par boite est de 40mg/ml.
Ø L’ensemencement se fait par écouvillonnage de la boite de Pétri avec une suspension de levure préparée.
Ø Des témoins contenant le milieu de culture sans extrait et les levures utilisées sont également préparés dans les mêmes conditions que celles des essais. Le milieu de culture est supplémenté en DMSO à la même concentration dans les boites témoins que dans les boites tests.
Ø Le fluconazole à la concentration de 100µg/ml est utilisé comme contrôle positif.
Ø L’ensemble des boites de Pétri est incubé à 37°C pendant 48 heures ; quotidiennement, la croissance des colonies sur chaque boite est appréciée et, à la fin du temps approprié d’incubation, les colonies sont dénombrées et les pourcentages d’inhibition évalués par la formule ci-après.
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PI : pourcentage d’inhibition ; Nbre : nombre
Seuls les extraits présentant un pourcentage d’inhibition supérieur ou égal à 75 % sur au moins deux des isolats de levures sont retenus pour la suite des essais. Chaque test est effectué deux fois.
IV.3.2. Sélection secondaire par la méthode de dilution en milieu liquide
La recherche de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits bruts est effectuée via la méthode de microdilution en milieu liquide inspirée du protocole CLSI M27-A3 (CLSI, 2008) auquel des ajustements ont été effectués.
Principe : Une série de dilutions successives de la solution stock de l’extrait à une concentration
suspension microbienne (levures) de titre connu. A l’issue du temps nécessaire d’incubation à la température requise, on détermine la croissance ou l’inhibition de la croissance des microorganismes, par une observation visuelle du culot formé par le dépôt de levures dans le bouillon de culture (CLSI, 2008).
Technique :
Ø Les essais sont effectués dans les microplaques de titration de 96 puits, fond en U. le bouillon Mueller Hinton (Oxoid, UK) est utilisé comme milieu de culture et est préparé suivant les instructions du fabricant, puis stérilisé à l’autoclave à 121°C pendant 15min. Ø Cent cinquante µl de milieu de culture stérile sont introduits dans les huit premières
cupules de la ligne 1 et 100µl dans le reste des cupules de la plaque ; ensuite, 50µl d’une solution d’un extrait concentré à 200 mg/ml sont prélevés et ajoutés aux 150 µl des premiers puits, diluant la concentration de ce dernier à 40mg/ml. Une série de dilutions de raison géométrique 2 est effectuée de la ligne 1 à la ligne 10 ; enfin, 50µl d’une suspension d’un seul isolat de levure, préparée au titre de 2.103 Cellules/ml sont ensemencés dans les cupules de la plaque (pour une concentration finale de 0,5.103 cellules/ml et un volume final de 200µl), excepté celles de la ligne 11 qui ne contiennent que le milieu de culture et servent donc de témoin de stérilité du milieu de culture ; les concentrations d’extraits dans les puits d’une colonne de la plaque vont de 40 à 0.0391 mg/ml. Le contrôle positif fluconazole a une gamme de concentration de 64 à 0,12µg/ml. Les essais sont effectués en duplicate.
Ø Les plaques ainsi préparées sont incubées à 37 °C pendant 48 heures. A l’issue du temps d’incubation, la plus petite concentration d’une ligne donnée dans une plaque n’ayant aucune croissance visible du microorganisme testé correspond à la CMI de l’extrait concerné.
Ø Les extraits ayant une CMI moyenne ≤5mg/ml avec une CMI médiane de 1,25mg/ml sur les 5 microorganismes testés sont retenus pour le fractionnement bio-guidé.