situ d'une Si-pyronine fluorescente après activation enzymatique
II.2. Synthèse du précurseur "cagé" conduisant à la formation de GD99 après activation enzymatique
II.2.3. Troisième stratégie : introduction tardive du motif formyle
Dans cette approche, l'aldéhyde est introduit sur l'hétérocycle N-méthylindoline en fin de synthèse. Ceci permet, en plus de contourner les problèmes de stabilité du groupement protecteur de cette fonction dans nos conditions de réactions, de réduire considérablement le nombre d'étapes de synthèse (Figure 23).
Figure 23. Stratégie de synthèse mettant en jeu une réaction de formylation tardive.
Dans un premier temps, la réaction de Hitchcock a été testée sur une échelle modeste (ca. 250 mg). GD137 a été engagé dans une réaction de lithiation conduisant à l'obtention du premier dérivé lithié qui, après avoir été additionné à une solution de dichlorodiméthylesilane permet l'obtention de l'intermédiaire de type monochlorosilane Si-Cl. En parallèle de cette addition, l'échange halogène-métal a été réalisé sur le composé GD116. Le deuxième dérivé lithié est obtenu et mis à réagir avec Si-Cl pour conduire, après une purification par chromatographie sur colonne de silice, au dérivé silylé non-symétrique GD142 avec un faible rendement (5%) (Schéma 10).
Lithiation & silylation
Réaction intermoléculaire de Hitchcock
All2N Br All2N Si N
Déprotection & introduction du motif enzymatique N Br Si N H N O Si N H N O O Introduction de l’aldéhyde via une réaction de
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Schéma 10. Synthèse du dérivé diaryldiméthylsilane mixte GD142 via une réaction de Hitchcock intermoléculaire. À ce stade, la quantité de GD142 obtenue n'a pas été suffisante pour pouvoir être engagée dans l'étape de formylation suivante. De plus, en sachant que la synthèse comporte encore trois étapes supplémentaires et en supposant que le rendement minimum de chacune des étapes soit de 50%, il faudrait une quantité de dérivé diaryldiméthylsilane importante pour espérer obtenir le composé final souhaité. En outre, l'efficacité de la réaction intermoléculaire de Hitchcock sur des petites quantités étant trop faible, la synthèse des précurseurs de départ en grandes quantités serait nécessaire. Ces études préliminaires ayant montrées les difficultés de mises en œuvre des réactions et les faibles rendements, il ne nous a pas semblé judicieux d'investir plus de temps dans la poursuite de nos recherches sur la synthèse de précurseurs "cagés" de Si-pyronines non symétriques.
III. Conclusions et perspectives
Les travaux présentés dans ce chapitre nous ont permis de mettre en avant les défis synthétiques liés au développement de précurseurs "cagés" conduisant (en théorie) à la formation
in situ d'une Si-pyronine non symétrique, suite à une activation enzymatique. La synthèse repose
sur une étape clé, une réaction de Hitchcock intermoléculaire, qui nécessite des choix réfléchis quant aux groupements protecteurs utilisés. Les conditions de réaction nécessitent une résistance de ces groupements vis-à-vis de bases très fortes (i.e., organolithiens) et un contrôle pointu des différents paramètres (i.e., température, vitesse et ordre d'addition des réactifs). Néanmoins, nous avons pu amorcer la conception d'une sonde de type "covalent assembly" conduisant à la formation de GD99 et explorer différentes stratégies de synthèse. La réactivité non usuelle du motif N-méthylindoline a ainsi été mise en évidence au travers de résultats inattendus et que nous n'avons pas réussi à expliquer de façon rationnelle à ce jour.
Les travaux sur le motif julolidine ont été également débutés et ne mettent pas en lumière de problème particulier concernant la protection de la fonction aldéhyde. En effet, le dérivé 1,3-dioxane GD168 (Figure 24) a été obtenu et le test de stabilité à l'organolithien t-BuLi a été concluant. Cependant, en raison de la faible quantité de produit à disposition (100 mg) et le faible rendement de l'étape de diméthylsilylation obtenu pour le précurseur "cagé" de GD99, nous n'avons pas envisagé la réaction de Hitchcock intermoléculaire avec ce composé.
All2N Br All2N SiCl 1. s-BuLi, THF, -78 °C, 45 min N Br Li N 2. Me2SiCl2, THF, -15 °C, 45 min All2N Si N s-BuLi, THF -78 °C, 45 min GD142 20 mg 5% GD137 GD116 Addition lente à -15 °C Si-Cl Si-Cl
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Figure 24. Dérivé de la 2-bromojulolidine dont l'aldéhyde est protégé par un motif 1,3-dioxane.
En effet, nous n'avons pas souhaité investir davantage de temps dans la resynthèse en grandes quantités (ca. 3 g) des synthons de départ qui auraient pu permettre de réaliser cette réaction à une échelle pour laquelle le contrôle des conditions aurait été facilité. Cependant par la suite, il serait intéressant de l'effectuer afin d'espérer obtenir les précurseurs "cagés" désirés et de pouvoir évaluer leurs efficacités et leurs intérêts applicatifs pour la détection d'enzymes bactériennes.
La complexité des synthèses de ces sondes nous a poussés à réfléchir à l'application du principe de "covalent assembly" à une autre famille de molécules fluorescentes. Celle-ci doit nous permettre d'obtenir plus rapidement et plus simplement de nouveaux substrats fluorogéniques non conventionnels et les fluorophores correspondants afin que nous puissions réaliser des essais de validations in vitro dans la foulée. Notre choix s'est ainsi porté sur la famille des quinoxalin-2(1H)-ones. En effet, elle semble répondre aux critères de simplicité synthétique (2 étapes de synthèse pour le fluorophore et 3 étapes pour la sonde). Ce projet a été porté par K. Renault qui a beaucoup travaillé sur ces molécules durant sa thèse49 et j'ai collaboré avec lui pour obtenir une première preuve de principe comme celle présentée dans la Figure 25. Il est toutefois important de souligner que ce type de structures ne permettra pas d'accéder à des sondes dont l'activation enzymatique conduirait, comme dans le cas des pyronines et de leurs analogues siliciés, à un signal de fluorescence dans l'orange ou le rouge lointain (voir le NIR-I), mais à des émissions dans la gamme spectrale du bleu-vert. Le développement des sondes de type "covalent assembly" conduisant à la formation in situ de quinoxalinone fera l'objet du prochain chapitre de ce manuscrit.
Figure 25. Sondes fluorescentes de type "covalent assembly" dont l'activation enzymatique conduira à la formation in
situ d'une quinoxalinone fluorescente.
49 K. Renault, "Développement de ligations chimiosélectives "click" : applications à la synthèse de sonde fluorescentes", Thèse de Normandie Université, 2018.
Br N O O GD168 MeO MeO NH NH R1 O O O R2 Enzymes ou (bio)analytes MeO MeO NH NH2 O R2 MeO MeO N H N O R2 Fluorescent ! R1CO2H Addition Nu & élimination H2O O Précurseur "cagé" non fluorescent
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