Sondes pro-fluorescentes enzymo-activables via la modification structurale d'un fluorophore structurale d'un fluorophore

Les sondes pro-fluorescentes permettant la détection d'une activité enzymatique sont connues depuis les années soixante sous le nom de substrats fluorogéniques d'enzymes71 (qui sera raccourci dans ce manuscrit par : substrats enzymatiques). Les différents exemples ci-dessus ont montré que la conception de sondes pro-fluorescentes enzymatiques, bien que fondée sur différents processus photophysiques, implique généralement une ou plusieurs modifications structurale(s) plus ou moins complexe(s) du fluorophore72.

Comme cela a été évoqué dans la partie II.1., le moyen le plus simple de masquer la fluorescence d'un fluorophore est de substituer l'un ou les deux motifs aniline primaire ou phénol (s'il en possède en son sein) dans le but d'altérer le caractère "push-pull" de la molécule (Figure 8A)73. Il est également possible de masquer des anilines secondaires, toutefois cela dépend de la structure et de la fonctionnalité du motif de reconnaissance choisi. Les dérivés de 7-amino/7-hydroxycoumarine illustrent bien cette stratégie. En effet, en substituant le phénol de la 4-méthylumbélliférone (4-MU) par un groupement acyle (R-C(O))74, un phosphate75 ou encore un

68 Pour les travaux sur la découverte du TTA, voir : C. A. Parker, C. G. Hatchard, Proc. Chem. Soc. , 1962, 147, 574-584.

69 Pour un exemple de ce type de sondes, voir : L. He, Q. Xu, Y. Liu, H. Wei, Y. Tang, W. Lin, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7, 12809-12813.

70 Pour des revues sur le sujet, voir : a) A. Kamkaew, S. H. Lim, H. B. Lee, L. V. Kiew, L. Y. Chung, K. Burgess, Chem. Soc.

Rev., 2013, 42, 77-88; b) H. Abrahamse, Michael R. Hamblin, Biochem. J., 2016, 473, 347-364. Pour des travaux sur

des dérivés Se-rhodamines, voir : a) J. E. Hill, M. K. Linder, K. S. Davies, G. A. Sawada, J. Morgan, T. Y. Ohulchanskyy, M. R. Detty, J. Med. Chem, 2014, 57, 8622-8634 b) M. W. Kryman, K. S. Davies, M. K. Linder, T. Y. Ohulchanskyy, M. R. Detty, Bioorg. Med. Chem., 2015, 23, 4501-4507.

71 J.-L. Reymond, V. S. Fluxà, N. Maillard, Chem. Commun., 2009, 34-46.

72 Pour deux revues sur les substrats fluorogéniques dérivés de petites molécules, voir : a) X. Chen, M. Sun, H. Ma, Curr.

Org. Chem., 2006, 10, 477-489; b) J. B. Grimm, L. M. Heckman, L. D. Lavis, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2013, 113,

1-34.

73 Pour deux revues sur l'altération du caractère "push-pull" des fluorophores, voir : a) W. Shi, H. Ma, Chem. Commun., 2012, 48, 8732-8744; b) F. Bureš, RSC Adv., 2014, 4, 58826-58851.

74 T. J. Jacks, H. W. Kircher, Anal. Biochem., 1967, 21, 279-285.

75 K. R. Gee, W.-C. Sun, M. K. Bhalgat, R. H. Upson, D. H. Klaubert, K. A. Latham, R. P. Haugland, Anal. Biochem., 1999,

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-sulfate76, la diversité des enzymes ciblées est simple à atteindre (Figure 24). Toutefois, la 4-MU libérée a tendance à diffuser ce qui peut nuire à la sensibilité de détection. De plus, son intensité de fluorescence dépend du pH du milieu (pKa = 7,8)75. Ces deux points seront revus plus en détails dans le chapitre 4.

La fluorescéine et ses dérivés sont aussi souvent utilisés dans la conception de sondes pro-fluorescentes enzymo-activables par substitution de ces groupements hydroxyles. Par exemple, en 2010, le groupe de R. T. Raines publie un dérivé bis-éther d'acétoxyméthyle (AM) de la fluorescéine (Figure 24) permettant la détection d'une activité estérase in vitro et in cellulo77. En effet, la

fonctionnalisation des fonctions phénols diminue fortement la polarité de la molécule ce qui favorise sa pénétration cellulaire. Toutefois, ces fluorophores, en plus de présenter une dépendance au pH, sont sensibles au photoblanchiment et l'équilibre entre la forme ouverte et la forme fermée de la spirolactame est parfois difficile à maîtriser.

De plus, en fonction du motif de reconnaissance enzymatique utilisé, l'extinction de la sonde peut ne pas être efficace à 100%, diminuant ainsi le rapport S/N et impactant négativement la sensibilité et la résolution de détection. C'est le cas, par exemple pour la sonde à tyrosinase, présentée dans la Figure 24, dont le motif de substitution n'altère pas suffisamment le système "push-pull" de la molécule78.

Figure 24. Structure des substrats enzymatiques dérivés de la 4-MU, conçus pour détecter un activité estérases ou lipase (R = acyle)74, phosphatase75 (R = PO32-) et sulfatase76 (R = SO3-) (à gauche), dérivé de la fluorescéine pour détecter une activité estérase77 (au milieu) et dérivé de la résorufine permettant de détecter un activité tyrosinase78 (à droite).

Un substrat enzymatique requiert donc de nombreuses caractéristiques, ces performances étant intimement liées à l'efficacité de la réaction fluorogénique libérant le fluorophore79. Cette dernière doit fonctionner en milieux aqueux et à pH physiologique en présence de nombreuses biomolécules (protéines, thiols, réducteurs, …) pouvant interagir avec le substrat et/ou les intermédiaires formés. Les produits de métabolisation doivent en outre présenter une faible toxicité (on pense notamment aux produits de décomposition de la "triggering unit" et/ou du bras espaceur auto-immolable).

76 G. G. Guilbault, J. Hieserman, Anal. Chem., 1969, 41, 2006-2009.

77 L. D. Lavis, T.-Y. Chao, R. T. Raines, Chem. Sci., 2011, 2, 521-530.

78 X. Wu, X. Li, H. Li, W. Shi, H. Ma, Chem. Commun., 2017, 53, 2443-2446.

79 Pour des revues récentes sur les substrats enzymatiques, voir : a) X. Wu, W. Shi, X. Li, H. Ma, Acc. Chem. Res., 2019,

52, 1892-1904; b) H. Singh, K. Tiwari, R. Tiwari, S. K. Pramanik, A. Das, Chem. Rev., 2019, 119, 11718-11760; c) S.

Singha, Y. W. Jun, S. Sarkar, K. H. Ahn, Acc. Chem. Res., 2019, 52, 2571-2581.

O O O

R = -R-C(O)-, -PO3^2-, -SO3 -Substrats enzymatiques dérivés de la 4-MU O O O O O O O ^O Substrat à estérases dérivé de la fluorescéine O N O O ^OH Substrat à tyrosinases dérivé de la résorufine R O

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-Afin de surmonter les inconvénients majeurs évoqués aux travers des exemples précédents qui sont : l'extinction de la fluorescence de la sonde non efficace à 100% qui entraîne un bruit de fond élevé et diminue le rapport S/N, la dépendance au pH de fluorophore, l'autofluorescence possible du milieu, la diffusion de la sonde dans le milieu et la sensibilité au photoblanchiment ; mais aussi la possible instabilité du substrat qui peut mener à l'élimination prématurée du fluorophore entraînant ainsi un résultat faux-positif, il existe différentes stratégies.

Une des approches actuellement privilégiée consiste à développer de nouveaux fluorophores à aniline ou à phénol. Notre groupe y contribue d'ailleurs activement via la conception de nouveaux dérivés de 7-hydroxycoumarine80, de DPP81 et d'hybrides DHX-hémicyanine82 fluorogéniques.

On peut également citer les sondes basées sur le phénomène de chimiluminescence83, qui contrairement aux sondes fluorogéniques ne nécessitent pas une excitation photonique pour produire une émission. Cette caractéristique va permettre de réduire considérablement le bruit de fond résultant de l'auto-fluorescence et de la possible diffusion de la lumière, améliorant ainsi la sensibilité et le rapport S/N84.

Une deuxième possibilité pour réduire le bruit de fond initiale de la sonde, est de réaliser la formation in situ du fluorophore. Ce concept, connu sous l'anglicisme de "covalent assembly"85, est basé sur un précurseur "cagé", dont la structure ne dérive pas de celle d'un fluorophore, et qui après réaction avec l'analyte va permettre la formation du fluorophore souhaité. En effet, la réaction domino déclenchée par la réaction entre l'analyte et le motif de reconnaissance va permettre la formation d'un système "push-pull" fluorescent (Figure 25). C'est sur ce concept que notre intérêt s'est porté. L'état de l'art, ainsi que les différentes solutions apportées aux principaux inconvénients des sondes conventionnelles, de ce mode de déclenchement seront présentés dans le chapitre 2 de ce manuscrit.

Figure 25. Représentation schématique du concept du "covalent assembly" menant à la formation intramoléculaire d'un système "push-pull". Illustration inspirée de la dernière revue du groupe de Y. Yang sur les sondes de type "covalent

assembly"85. (D : donneur, A : accepteur).

80 a) J.-A. Richard, M. Massonneau, P.-Y. Renard, A. Romieu, Org. Lett., 2008, 10, 4175-4178; b) B. Roubinet, P.-Y. Renard, A. Romieu, Dyes Pigm., 2014, 110, 270-284; c) B. Roubinet, A. Chevalier, P.-Y. Renard, A. Romieu, Eur. J. Org.

Chem., 2015, 2015, 166-182.

81 F. Ponsot, "Hybrides bactériochlorine-dicétopyrrolopyrrole (DPP) : Nouveaux fluorophores proche infrarouge pour des applications en biodétection/bioimagerie", Thèse de l'Université de Bourgogne Franche-Comté, 2020.

82 H. Chen, B. Dong, Y. Tang, W. Lin, Acc. Chem. Res., 2017, 50, 1410-1422.

83 Pour deux revues récentes sur les sondes chémoluminogénique, voir : a) N. Hananya, D. Shabat, Angew. Chem. Int.

Ed., 2017, 56, 16454-16463; b) S. Gnaim, D. Shabat, Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 1389-1394.

84 J. Yan, S. Lee, A. Zhang, J. Yoon, Chem. Soc. Rev., 2018, 47, 6900-6916.

85 Pour la première revue sur les sondes fluorogéniques enzymatiques de type "covalent assembly", récemment parue, voir : X. Luo, L. Gu, X. Qian, Y. Yang, Chem. Commun., 2020, 56, 9067-9078.

"covalent assembly"

D D

A

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