Chapitre 3 : Investigation phytochimique de lichen du genre Cladonia 46
3. Travaux en cours et perspectives 72
3.1 Activité biologique des métabolites isolés
Parmi les quatre composés isolés, l’acide usnique est le métabolite dont les propriétés biologiques ont été les plus investiguées. Il est d’ailleurs le métabolite lichénique le plus étudié pour ses activités antimicrobiennes, antivirales, anti protozoaires, antiprolifératives, anti-inflammatoires, analgésiques, anti tumorales, cytotoxiques et antipyrétiques, antioxydantes, gastro protectives, cardiovasculaires et immunostimulantes.72,73,74 En raison
de la diversité des propriétés biologiques qui ont été déjà rapportées dans la littérature pour l’acide usnique, il a été jugé inutile de poursuivre des recherches sur ce sujet. Dans le cas des trois autres métabolites, l’acide olivetolique, l’acide 4-O-méthylolivetolcarboxylique et l’acide perlatolique, leurs activités biologiques demeurent très peu étudiées, même s’ils ont été isolés de plusieurs lichens. Une revue de littérature des propriétés biologiques de ces trois produits naturels a été effectuée précédemment à la section 1.3 du chapitre 3. Les activités antibactériennes, antifongiques et antioxydantes ont été largement étudiées toutefois des activités anti-inflammatoires prometteuses ont été rapportés par Sankawa et al. (1982),100 Bauer et al. (2012)71 et Oettl et al. (2013)75. Afin de poursuivre l’étude des
propriétés anti-inflammatoire de l’acide perlatolique et de ses monomères, de plus grandes quantités sont nécessaires. Pour ce faire, nous avons entrepris la synthèse de ces composés qui est présentée au chapitre 5. Les activités anti-inflammatoires précédemment rapportées pour ces trois métabolites y sont aussi détaillées.
3.2 Investigations phytochimiques préliminaires des extraits de C. mitis et des extraits hexane et méthanol de C. stellaris
3.2.1 Préparation des extraits bruts de C. mitis
L’investigation phytochimique du lichen Cladonia mitis a aussi été débutée. Le lichen C.
mitis a d’abord été extrait de la même façon que C. stellaris à l’aide d’un gradient de
polarité pour obtenir trois extraits bruts. Des pourcentages d’extraction de 0,61 %, 0,77 % et 1,7 % ont respectivement obtenu pour l’hexane, le dichlorométhane et le méthanol. C’est résultats sont très similaires aux taux d’extraction de 0,62 %, 0,79 % et 1,9 % qui avaient
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été obtenus pour C. stellaris. La composition chimique ou plutôt la polarité des métabolites des deux lichens doit être très semblable.
Tableau 7. Préparation des extraits bruts du lichen C. mitis Lichen sec
(g) Solvant Masse de l’extrait (g) Extraction (%)
165,9
Hexanes (3 x 600 mL) 1,02 0,61
DCM (4 x 600 mL) 1,27 0,77
MeOH (4 x 600 mL) 2,84 1,7
3.2.2 Criblage biologique des extraits bruts de C. mitis
Les extraits dichlorométhane et méthanol ont été soumis à deux tests biologiques qui sont impliqués dans les étapes de la carcinogenèse. L’activité anti-inflammatoire de l’extrait dichlorométhane de C. stellaris envers le facteur de transcription nucléaire NF-κB a été rapportée précédemment à la section 2.3 du chapitre 3. Dans le cas des extraits de C. mitis, aucune activité anti-inflammatoire n’a été détectée, mais l’extrait méthanol est toutefois en mesure d’induire la synthèse de la quinone réductase. Il pourrait ainsi être pertinent de tenter d’isoler et d’identifier le ou les composés responsables de cette activité. Il serait aussi intéressant d’isoler et d’identifier les composés cytotoxiques envers les cellules Hepa-1c1c7 (quinone réductase) des extraits dichlorométhane de C. stellaris et C. mitis.
Tableau 8. Criblage biologique des extraits bruts de C. mitis Extrait (µg/mL) Conc. (% inhb.) NF-κB Viabilité (%) Activité Hepa QR
1c1c7
Viabilité
(%) Activité
CM DCM 20 66,6 38,7 X 2,92 21 X
CM MeOH 20 10,0 94,3 - 2,29 98 +
x : toxique + : actif au test biologique - : aucune activité
3.2.3 Comparaison de la composition chimique des extraits bruts
Suite au criblage biologique des études phytochimiques préliminaires des extraits CS MeOH, CS Hex, CM DCM, CM MeOH et CM Hex ont été réalisés par HPLC-PDA-MS
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afin de comparer la composition chimique. Pour chacun des extraits, les ions ont été générés par électronébulisation et détectés par spectrométrie de masse à temps de vol (ESI- TOF). Les rapports masse sur charge (m/z) des ions obtenus pour chaque intervalle des chromatogrammes sont présentés au tableau 9. Les chromatogrammes enregistrés par le spectromètre UV-visible et le spectromètre de masse figurent à l’annexe 7.
L’analyse des ions détectés a permis de conclure que la composition chimique des trois extraits du lichen C. stellaris est similaire. En effet, à partir de 1900 secondes les extraits méthanol et hexane contiennent tous les ions de l’extrait dichlorométhane. Dans le cas des quatre métabolites qui ont été isolés et identifiés pour l’extrait dichlorométhane de C.
stellaris, certains ont aussi été identifiés dans les deux autres extraits. L’acide usnique qui
est le métabolite principal des lichens du genre Cladonia est bien attendu présent dans les trois extraits malgré sa faible solubilité dans le méthanol. L’ion [M-H]- à 443 m/z de l’acide
perlatolique a aussi été détecté pour les trois extraits. Dans le cas de l’acide olivetolique, il n’a pas été détecté dans l’intervalle 1500-1700 secondes pour les extraits méthanol et hexane alors que son dérivé méthoxy, qui est associé à l’ion [M-H]- à 237 m/z de
l’intervalle 1700-1900 secondes, est présent dans l’extrait hexane alors qu’il ne l’est pas pour l’extrait méthanol En se basant sur ces résultats, on peut conclure que la présence de l’acide perlatolique dans l’échantillon n’implique pas que les unités monoaromatiques à partir desquelles il est formé par estérification, seront aussi dans l’extrait brut.
La principale différence de composition chimique entre les extraits du lichen C. stellaris et C. mitis est l’absence de l’acide perlatolique. C’est ce qui explique pourquoi aucune activité anti-inflammatoire n’a été détectée au test d’inhibition de NF-κB. L’ion [M-H]- à 443 m/z a
toutefois été détecté pour l’extrait hexane. Cependant, aucun signal UV n’a été enregistré au temps de rétention correspondant à l’acide perlatolique (2948-2978 s) pour cet extrait (voir annexe 7). Ce depside doit ainsi être en très faible concentration dans l’extrait hexane. De plus, les ions correspondant à l’acide olivetolique et l’acide 4-O- méthylolivetolcarboxylique n’ont pas été obtenus pour les trois extrais de C. mitis. Parmi les quatre métabolites isolés de C. stellaris, il y a seulement l’acide usnique qui est présent.
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Tableau 9. Ions moléculaires obtenus lors de l’analyse des extraits bruts par HPLC-MS
Dans le cas des extraits hexane de C. stellaris et C. mitis, leurs compositions en métabolites semblent être assez différente de celles des extraits méthanol et dichlorométhane. Les probabilités d’isoler ces métabolites minoritaires suite à un fractionnement sont plutôt faibles étant donné que seulement 1 g d’extrait brut est disponible. Lors du fractionnement de l’extrait dichlorométhane, 1,4 g ont été séparés par MPLC et seulement deux métabolites
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minoritaires ont été isolés en assez grande quantité pour être caractérisé par RMN. Pour tenter d’identifier des métabolites inédits et qui ont déjà été rapportés dans la littérature, la technique de choix serait la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (HPLC-RMN). La HPLC-NMR est une technique complémentaire à la HPLC-UV-MS puisqu’elle permet d’associer une structure aux métabolites sans avoir à les isoler.101 Dans le cas des extraits méthanol des lichens C.
stellaris et C. mitis, une tentative de fractionnement dans le but d’isoler des métabolites
minoritaires qui n’ont pas été isolés pour l’extrait DCM pourrait être effectuée étant donné qu’entre 3 et 4 g d’extrait brut ont été obtenus par macération.
3.3 Conclusion
L’isolation de l’extrait dichlorométhane de C. stellaris a permis d’apprendre les rudiments de l’extraction, l’isolement, la purification et l’élucidation de la structure de produits naturels. L’investigation phytochimique de cet extrait a aussi mené à l’isolation de six métabolites secondaires. Parmi ceux-ci, quatre ont été identifiés soient l’acide olivetolique, l’acide 4-O-méthylolivétocarboxylique, l’acide perlatolique et l’acide usnique. Malgré le fait que les quatre composés identifiés ne sont pas nouveaux, leurs activités biologiques demeurent très peu étudiées. De plus, l’activité anti-inflammatoire qui a été détectée pour l’extrait DCM de C. stellaris lors du criblage biologique a été associée principalement à l’acide perlatolique. Dans le cas des acides olivetolique et 4-O-méthylolivétocarboxylique, ils seront synthétisés pour poursuivre l’étude de leurs propriétés anti-inflammatoires (chapitre 5). L’élucidation de la structure des deux molécules non identifiées devra être terminée étant donné que ces composés ne semblent pas être rapportés dans la littérature pour les lichens Cladonia. Finalement, l’investigation phytochimique des extraits méthanol de C. mitis et C. stellaris pourra être poursuivie en effectuant un fractionnement par MPLC pour tenter d’isoler des composés minoritaires qui n’ont pas été isolés pour l’extrait DCM du lichen C. stellaris.
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Chapitre 4 : Investigation phytochimique du lichen Stereocaulon paschale