Fractionnement et purification 59

Avant d’effectuer le fractionnement de l’extrait à l’échelle du gramme, le gradient optimisé a été testé avec une colonne analytique dont la taille des particules est plus élevée. L’objectif était d’étudier l’effet de la taille des particules sur la résolution. Pour ce faire une colonne analytique de mêmes dimensions (4,6 x 250 mm), mais dont la taille des particules est de 15-25 µm au lieu de 5 µm. Lors du fractionnement à grande échelle, la taille des

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particules est de 25 µm, cette analyse a ainsi permis d’avoir une idée de la résolution qui sera obtenue.

Figure 20. Optimisation du gradient d’élution pour augmenter la résolution

À la figure 20, pour le gradient A, une moins bonne séparation des composés entre 30 et 40 min a été obtenue. Dans le but d’obtenir des fractions pures lors du fractionnement, une étape isocratique à 80 % méthanol a été ajoutée pour élargir les pics des composés. En élargissant les pics, les chances qu’une des fractions associées au pic soit pure sont plus élevées. Le nouveau gradient a utilisé pour l’isolation à l’échelle du gramme est composé d’une première étape avec gradient (60 à 80 % MeOH en 25 min), suivie d’une étape isocratique (80 % MeOH pendant 35 min) pour finir avec une étape avec gradient (80 à 100 % MeOH en 20 min).

Suite à la détermination de ce gradient, la transposition géométrique a été effectuée pour déterminer le débit à utiliser à l’échelle préparative afin d’assurer une résolution similaire. Selon les dimensions de la colonne préparative, un débit de 113 mL/min était suggéré. Toutefois, la colonne MPLC en verre ne peut pas supporter des pressions supérieures à 40 bars.34 _{En tenant compte de cette limitation, le débit équivalent géométriquement (113}

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débit a donc été ajusté à 10 mL/min pour être en dessous de la limite maximale de la pression tolérée. Un système permettant de chauffer le solvant aurait pu être utilisé pour augmenter le débit à environ 15 mL/min en diminuant la viscosité de la phase mobile. Cependant, il a été déterminé précédemment que l’extrait contenait des métabolites thermosensibles. À partir du débit de 10 mL/min, un délai d’injection de 55,79 min a été déterminé. Une étape isocratique à la composition initiale de la phase mobile a ainsi été ajoutée avant le gradient.

Tableau 5. Transposition géométrique des conditions d’élution

Échelle analytique  Échelle préparative  Longueur de la colonne  250 mm  Longueur de la colonne  460 mm  Diamètre de la colonne  4,6 mm  Diamètre de la colonne  49 mm  Taille des particules  25,0 μm  Taille des particules  25,0 μm  Volume mort de la col.  2,64 mL  Volume mort de la col.  510 mL  Volume Dwell du syst.  0,95 mL  Volume Dwell du syst.  12,0 mL 

Débit  1 mL/min  Débit suggéré  113 mL/min

Volume injection  10 μL  Volume inj. suggéré  2,09 mL  Débit déterminé  10 mL/min 

      Délai d’injection  55,79 min 

En raison de la diminution importante du débit, le temps d’élution pour la fragmentation a drastiquement augmenté à environ 27 h. Le fractionnement ne pouvait être effectué en continu sans supervision étant donné que le collecteur de fractions doit être vidé et rempli avec de nouveaux tubes. Le fractionnement a donc été divisé en trois parties qui correspondent aux trois étapes du gradient soient l’augmentation de la composition en méthanol de la phase mobile de 60 à 80 % en 8 h 30, puis une étape isocratique à 80 % méthanol pendant 11 h pour terminer avec une étape de 7 h 20 durant lequel la composition de la phase mobile passe de 80 à 100 % méthanol (figure 21). Pour l’injection, l’extrait brut a été placé dans une cellule en aluminium qui était relié à la pompe et à la colonne. Lorsque la phase mobile passe dans la cellule, les composés sont entraînés dans la colonne par le solvant. Avant d’être inséré dans la cellule, l’extrait brut a été mélangé avec de la silice C18 (40-63 µm) et du sable d’Ottawa dans un rapport d’une portion d’extrait pour 3-4 portions

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de phase stationnaire et 1-2 portions de sable. Le sable d’Ottawa est ajouté pour faciliter l’incorporation de l’extrait dans la silice pour former un mélange homogène.

Figure 21. Fractionnement de l’extrait brut par MPLC (A) Montage utilisé pour l’injection solide du mélange brut 34 _{(B) Composition du mélange brut (C) Chromatogramme obtenu} pour le fractionnement de l’extrait dichlorométhane de C. stellaris

Un chromatogramme très similaire à celui obtenu à l’échelle analytique a été enregistré lors du fractionnement de 1,4 g d’extrait brut (figure 21). Cette isolation a mené à l’obtention de 72 fractions qui ont été analysées par UPLC-PDA-ESLD afin de localiser les composés, d’analyser la pureté et de combiner les fractions mixtes ayant la même composition chimique. Pour chacune des fractions, la masse, les composés présents et le temps de rétentions du composé majoritaire sont présentés au tableau 6 où les composés majoritaires sont en rose.

Dans le cas des composés 0, 1, 4, 5 et 8, ils ont directement été obtenus pur du fractionnement par MPLC. Ces cinq métabolites ont ainsi été caractérisés par spectrométrie de masse et RMN sans étapes supplémentaires de purification. Le composé 0 n’avait pas

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été détecté lors du profilage des métabolites par HPLC-PDA-ELSD en raison de sa très faible concentration dans l’échantillon. Lors de la localisation, il a été surprenant d’observer que le composé 8 est présent à partir de la fraction 34 jusqu’à la dernière fraction. Ce résultat peut s’expliquer par le fait que l’acide usnique (composé 8) est très soluble dans les solvants chlorés tel le dichlorométhane alors qu’il est pratiquement insoluble dans l’eau et peu soluble dans le méthanol.62 _{On le retrouve en grande quantité}

dans l’extrait dichlorométhane, mais lors de l’injection le composé 8 est très peu soluble à cause de la présence d’eau dans la phase mobile.94

Tableau 6. Analyse des fractions et location des composés par UPLC-PDA-ELSD

Au fur et à mesure que la proportion de méthanol augmente, il est de plus en plus entraîné dans la colonne. C’est pourquoi on observe une montée constante du signal UV à partir de la fraction 36 et que les composés 10 et 11 n’ont pas été obtenus pur. Les composés 10 et

11 ont été localisés respectivement dans les fractions 44 à 56 et 63 à 69 qui contiennent

aussi le composé 8 (acide usnique). Les fractions 45 à 48 ont été rassemblées en une fraction mixte puisqu’elles renfermaient une proportion élevée du métabolite 10. À l’opposé, une très faible concentration du métabolite 10 a été détectée dans les fractions 44 et 50 à 56. De façon analogue, les fractions 63-65 contenaient de faibles traces du métabolite 11. Par contre, les fractions 66-69 renfermaient des quantités importantes du

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composé 11 dans chacune d’elle. La fraction 45-48 et la fraction 67 ont ainsi été sélectionnées pour tenter d’obtenir les composés 10 et 11 avec une bonne pureté et à l’échelle du milligramme.

Afin de les purifier par HPLC semi-préparative, le gradient d’élution a été optimisé par HPLC analytique pour chacune des fractions (annexe 6). Dans le cas de la fraction 67, une différence d’environ 5 min de rétention a été obtenue entre les composés 8 et 11 avec un gradient linéaire de 80 à 100 % méthanol en 20 min. La purification de la fraction mixte 45- 48 sera un peu plus ardue étant donné qu’il y a environ une minute de différence entre les métabolites 8 et 10 pour l’échelle analytique (80 % méthanol pendant 35 min). La fraction mixte 45-48 n’a pas pu être purifiée par HPLC semi-préparative en raison de la faible solubilité des composés. Lors de la préparation de l’échantillon, la fraction a tenté d’être solubilisée dans la phase mobile (80 % MeOH : 20 % H2O), puis dans le méthanol et

finalement quelques gouttes de DMSO ont même été ajoutées. Un échantillon a été préparé en ajoutant 10 % de DMSO puis en ajoutant le double de méthanol prévu. La solution a ensuite été filtrée, puis une petite quantité a été injectée dans le HPLC, aucun signal du composé 10 n’a été obtenu étant donné que le composé doit être en très petite quantité dans l’échantillon. Lors de l’analyse de cette fraction par HPLC-PDA-ELSD aucun signal n’avait été enregistré par le détecteur ELSD pour le composé 10 ce qui confirme sa très faible concentration. De plus, en raison de sa faible solubilité dans la phase mobile, il peut précipiter avant d’atteindre la colonne et/ ou trainer dans la colonne. Dans le cas de la fraction 67, des problèmes similaires de solubilité ont été rencontrés. Ces problèmes ont par contre facilité la séparation comme le composé 8 (acide usnique) n’est pas très soluble dans le méthanol alors que le composé 11 est assez soluble. Lors de la préparation, l’échantillon a été centrifugé pour récupérer seulement le surnagent qui a été injecté dans le HPLC. Sur le chromatogramme de la figure 22, il y a ainsi très peu de signal associé au composé 8 comme la majorité de la masse du métabolite à rester dans le précipité. Le composé 11 a donc été facilement récupéré avec une excellente pureté comme le démontre l’analyse par HPLC analytique de la fraction après purification.

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Figure 22. Purification de la fraction 67 par HPLC semi-préparative

Nous n’avons pas tenté de purifier les composés 2, 3, 6 et 7 puisque les taux de récupération lors d’une purification par chromatographie semi-préparative sont peu élevés (50-80 %) en raison de plusieurs facteurs.95 _{Le réglage du détecteur est le premier}

paramètre qui influence à la baisse les taux de récupération. Lorsque le détecteur est mal réglé, il peut y avoir un délai de quelques secondes avant que le logiciel (ordinateur) reçoive le signal détecté. Dans certains cas où des débits élevés sont utilisés, le composé peut même atteindre le collecteur de fraction avant que le signal soit envoyé au logiciel. À l’opposé, lorsque le volume de retard (delay volume) est trop grand, il peut y avoir un délai de plusieurs secondes avant que le composé qui a été détecté atteigne le collecteur à cause de la longueur du tube qui relie la cellule du détecteur au collecteur. Finalement, une certaine perte est toujours associée à la rétention anormale du composé dans la colonne. Dans le cas des fractions mixtes de 5 à 15 mg, il est donc difficile de récupérer en assez

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grande quantité des composés purs pour les caractériser étant donné qu’environ 2 mg de produit pur sont nécessaires pour effectuer une caractérisation RMN complète.