Analyse par HPLC-PDA-ELSD-MS 54

L’extrait dichlorométhane du lichen Cladonia stellaris a d’abord été analysé par HPLC- PDA-ELSD dans le but d’optimiser le gradient d’élution pour obtenir la meilleure séparation possible des métabolites contenus dans l’extrait (section 2.5, chapitre 2). Pour ce faire, un échantillon de l’extrait brut ayant une concentration de 10 mg d’extrait dans 1 mL de méthanol a été séparé en phase inverse à l’aide d’une colonne analytique de type C18 et en utilisant une phase mobile composée d’eau et de méthanol (figure 17). Le gradient d’élution de 60 à 100 % méthanol en 40 min suivie d’une étape isocratique de 10 min à 100 % méthanol a été choisi pour la poursuite de l’investigation phytochimique étant donné que les temps de rétentions les moins élevées ont étés obtenus avec ce gradient en plus d’obtenir une très bonne résolution.

Un premier criblage chimique des métabolites contenus dans l’extrait brut a été effectué par HPLC-PDA-ELSD en utilisant le gradient d’élution optimisé. Cette première analyse chimique avait comme objectifs de déterminer le nombre de composés dans l’extrait et de tenter de déterminer la classe de composé (monoaromatique, depsides, depsidones, etc.) par l’analyse du spectre UV associé à chacun des métabolites détectés.33 _{En comparant le}

chromatogramme enregistré à 254 nm à celui ELSD, il est possible d’avoir une idée de la proportion des métabolites dans l’échantillon, car le signal enregistré par le détecteur est proportionnel à la quantité de chaque molécule présente dans l’échantillon.47 _{Au total,}

douze métabolites ont été détectés par le détecteur UV (PDA) à une longueur d’onde de 254 nm. Dans le cas du détecteur ELSD, seulement deux signaux avaient une bonne intensité, soit les composés majoritaires 8 et 11. Il est clair que l’extrait est constitué de plusieurs métabolites minoritaires qui sont en très faible quantité comme les métabolites entre 10 et 30 min qui absorbent à 254 nm et n’ont pas été détectés par le détecteur ELSD.

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Figure 17. Profilage des métabolites de l’extrait DCM de C. stellaris par HPLC-PDA-ELSD

Les spectres UV des douze chromophores sont présentés à la figure 17. Selon la littérature, l’acide usnique et l’acide perlatolique sont habituellement les deux métabolites majoritaires du lichen Cladonia stellaris 70,90 _{Le contenu en acide usnique peut même représenter}

jusqu’à 2 % de la masse sèche du lichen.62,91 _{Le spectre UV du composé 8 est}

caractéristique des dibenzofuranes qui ont habituellement deux maximums d’absorption entre 220 et 300 nm.33 _{Dans le cas de l’acide usnique, le maximum d’absorption ayant la}

plus grande absorptivité molaire est environ à 232 nm alors que le deuxième maximum est à environ 282 nm,92 _{le spectre UV du composé 8 semble concorder parfaitement avec ces}

données spectrales. Dans le cas de l’acide perlatolique, il pourrait être associé au deuxième composé majoritaire soit le métabolite 11, car le spectre UV est similaire à celui rapporté dans la littérature par Cuberson : λmax (logɛ) 216 (4,64) 270 (4,26) et 307 (4,04).68 Pour

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analyses supplémentaires de spectroscopie infrarouge et RMN seront nécessaires, car les spectres UV des composés de type monoaromatique et depside sont très semblables. Par exemple, dans le cas de l’éthylolivetolcarboxylate, un monoaromatique rapporté pour le lichen C. stellaris, des maximums d’absorption sont présents à 214 (4,47), 262 (4,14) et 301 (3,73) alors que pour l’acide obtusatique, un depside aussi présent dans le lichen C.

stellaris le spectre UV est très semblable : 214 (4,57), 274 (4,27) et 303 (3,98).15,70,89

Pour évaluer s’il y a dégradation des métabolites lorsqu’ils sont en solution dans le méthanol, un nouvel échantillon de l’extrait dichlorométhane a été préparé, puis analysé par HPLC avec détection UV. Suite à cette analyse, il a été déterminé que les échantillons devaient être entreposés à environ 5 °C et à l’abri de la lumière pour éviter que les composés photo- et/ou thermo- sensibles se dégradent étant donné que la composition chimique de l’extrait variait beaucoup dans le temps. Lors des étapes de micro- fractionnement et de fractionnement, les fractions obtenues devront également être réfrigérées, protégées de la lumière et évaporées rapidement. L’optimisation du gradient d’élution et l’analyse de la dégradation de l’extrait DCM de C. stellaris par HPLC-PDA sont présentées aux annexes 4 et 5.

Afin de poursuivre le criblage chimique des composés présents dans l’extrait brut, l’échantillon a aussi été analysé par HPLC-PDA couplé à la spectrométrie de masse pour tenter d’identifier des composés connus dans la littérature à partir des masses moléculaires qui sont obtenus de la masse des ions moléculaire ([M]+_{) et de la masse des fragments.}37

Pour cette analyse, les métabolites ont été ionisés par électronébulisation en mode négatif et détectés la technique de temps de vol (ESI-TOF). Le nouveau gradient à utiliser pour obtenir une séparation et un chromatogramme similaire a été obtenu en effectuant une transposition géométrique (figure 18).

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Figure 18. Profilage des métabolites de l’extrait DCM de C. stellaris par HPLC-PDA-HRMS

Les temps de rétention des composés et les ions associés sont présentés à la figure 18. Le chromatogramme enregistré à 254 nm est très similaire à celui obtenu par HPLC-PDA (figure 17), les composés 8 et 11 ont ainsi été assignés respectivement aux signaux ayant un temps de rétention de 2490-2514 s et de 2948-2979 s. L’analyse du spectre UV du composé

8 avait permis d’assigner ce métabolite à l’acide usnique, l’ion à 343,0872 m/z ([M-H]-₎

confirme aussi cette assignation. Dans le cas du composé 11, un ion à 443,2071 m/z ([M- H]-_{) a été obtenu et suggère aussi la présence de l’acide perlatolique dans l’extrait.}

Polovinka et al. ont précédemment rapporté que le lichen C. stellaris contenait quatre composés monoaromatiques : l’acide 4-O-méthylolivetolcarboxylique (238 m/z), l’acide olivetolique (224 m/z), l’éthyl-2,4-dihydroxy-6-pentylbenzoate (252 m/z) et l’éthyl-2- hydroxy-4-méthoxy-6-pentylbenzoate (266 m/z). Parmi ces quatre composés, deux ions correspondant aux ions moléculaires moins un hydrogène de l’acide olivetolique et de son

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dérivé méthoxy en position 4 ont été obtenus respectivement à 1505-1524 s (223,0631 m/z) et 1744-1791 (237,1150 m/z). Les acides psoromique, déméthylpsoromique, evernique, olivetorique, 4-O-méthylolivetorique et l’atranorine sont les six autres métabolites qui ont déjà été isolés du lichen C. stellaris,70 _{toutefois seulement l’ion à 485,2204 pourrait}

correspondre au depside qui dérive de l’acide olivetorique (486 m/z). Une revue de littérature sur les métabolites isolés du genre Cladonia a été décrite à la section 1.3 du chapitre 3.15,70,93 _{Parmi ces composés, la plupart sont des depsides et certains peuvent être}

spécifique à une espèce alors que d’autres sont communs à plusieurs espèces du genre

Cladonia. Les masses moléculaires de ces métabolites ont été comparées avec les ions

obtenus dans le but de cibler des métabolites qui pourraient être présents dans l’extrait dichlorométhane de C. stellaris. Afin de simplifier l’analyse, il a été assumé que les ions étaient de type [M-H]-_{. Les composés supposés sont présentés au tableau de la figure 18.}