Caractérisation et identification 66

L’isolation de l’extrait dichlorométhane de C. stellaris a mené à l’isolation de 6 composés et l’identification de quatre des six métabolites soient l’acide olivetolique, l’acide 4-O- méthylolivetolcarboxylique, l’acide usnique et l’acide perlatolique (figure 23). La caractérisation des composés par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) et par RMN est présentée à la partie expérimentale du chapitre 3. L’élucidation des structures est détaillée ci-après.

Figure 23. Identification des composés isolés de l’extrait C. stellaris

Composé 0 – fraction 10 :

Le composé 0 a été isolé sous la forme d’un solide blanc jaunâtre. La formule brute C12H16O4 a été déduite à partir des ions moléculaires [M-H]- à 223,0980 m/z et [M+H]+ à

225,1127 m/z obtenus pour le spectre de masse haute résolution par électronébulisation en mode négatif et positif. L’analyse de l’extrait brut par HPLC-PDA-MS avait précédemment mis en évidence la présence possible de l’acide olivetolique (224,1049 m/z). Les ions [M+H-H2O]+ et [M-H-COOH]- ont aussi été détectés ce qui confirmer la présence d’une

fonction acide carboxylique sur la molécule. Le spectre RMN 1_{H a quant à lui montré la}

présence de deux protons aromatiques (6,10 et 6,20 ppm) et d’une chaîne aliphatique à cinq carbones (CH2 aliphatique entre 1,29 et 2,95 ppm et un CH3 à 0,90 ppm). Le signal d’une

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aromatique. Malgré le niveau de pureté peu élevé et les signaux larges du spectre RMN 1_H,

il a été possible de conclure qu’il s’agit ainsi bien de l’acide olivetolique. Le spectre RMN

1_{H concorde avec ceux de la littérature.}96

Figure 24. Ions moléculaires obtenus lors de l’analyse du composé 0 par HRMS

Composé 5 – fraction 20 :

Le composé 5 est un dérivé de l’acide olivetolique, les ions moléculaires [M-H]- _{à 237,1132}

m/z et [M+H]+ _{à 239,1278 m/z qui correspondent à la formule brute C13H19O4,mettent en}

évidence la présence d’un groupement CH3 supplémentaire. Sur le spectre RMN 1H à la

différence du composé 0, un groupement méthoxy à 3,68 ppm est en effet présent. De façon similaire au composé 0, les ions associés respectivement à la perte d’une molécule d’eau et à la perte d’un groupement COOH sont aussi sur les spectres ESI-HRMS en mode positif et négatif. Les signaux obtenus pour les protons du composé étaient beaucoup moins larges que ceux du composé précédent dû à une meilleure solubilité. Le spectre RMN 1_{H a ainsi}

révélé la présence d’un CH3 (triplet, 3H) à 0,85 ppm, de deux CH2 (multiplet, 4H) en milieu

de chaîne entre 1,19 et 1,29 ppm, d’un CH2 (multiplet, 2H) à 1,48 ppm et d’un CH2 (triplet,

2H) adjacent au cycle aromatique à 2,90 ppm qui constituent la chaîne aliphatique de cinq carbones. Les deux signaux d’intensité 1H dans la zone aromatique ont été associé à deux protons aromatiques en position meta l’un de l’autre. Ce composé est l’acide 4-O- méthylolivetolcarboxylique comme il avait été suggéré suite à l’analyse par HPLC-PDA- MS. Le spectre RMN 1_{H concorde avec ceux de la littérature.}96

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Composé 8 – fraction 61 :

La caractérisation du composé 8 pur par RMN et spectrométrie de masse a permis de confirmer qu’il s’agit bien de l’acide usnique. Le spectre RMN 1_{H a révélé la présence de}

signaux caractéristiques soient quatre groupements CH3 (1,73-2,66 ppm) qui sont associés

aux deux fonctions acétyle, au méthyle du carbone stéréogénique du cycle B et au méthyle du cycle aromatique A. Les protons de deux fonctions alcool et le proton du cycle B sont aussi présents respectivement à 13,5 ppm, 11,46 ppm et 6,25 ppm. L’analyse des spectres RMN 13_{C, HSQC, COSY, HMBC a permis d’assigner sans équivoque le composé 8 à}

l’acide usnique. Les corrélations obtenues en HMBC entre les hydrogènes du méthyle du cycle B et les carbones C1, C2, C6 et C7 de même que les interactions entre les hydrogènes du méthyle du cycle aromatique A avec les carbones C10, C11 et C12 confirme que le composé 8 est bien l’acide usnique et non son isomère l’acide isousnique.97 _{Les ions}

à 345 m/z, 327 m/z et 303 m/z obtenus par ESI en mode positif ont été rapportés dans la littérature et correspondent au gain d’un proton, à la perte d’une molécule d’eau et à la perte d’un groupement acétyle (CH2OH). Ces deux derniers ions sont formés suite à la

fragmentation de la molécule protonée.92 _{En mode d’ionisation négative, l’ion moléculaire}

[M-H]- _{a été obtenu. De plus, la fragmentation de l’ion [M-H]}- _{a mené à deux ions}

spécifiques à l’acide usnique soit les ions [M-H-CH3·]·- et [M-H-C4H4O2]- . Ils ont été

formés suite à la perte d’un radical méthyle (328 m/z) et dans l’autre cas à la perte d’un fragment de 84 m/z qui provient d’un réarrangement de type rétro Diels-Alder.98

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Composé 11 – fraction 67 :

Le composé 11 a été obtenu avec une excellente pureté suite à la purification par HPLC semi-préparation. Des spectres RMN très clairs ont ainsi été obtenus ce qui a grandement facilité l’élucidation de la structure par l’analyse des spectres RMN. Le spectre RMN 1_H

était très similaire à celui du composé 0 et du composé 5. La seule différence entre le spectre du composé 11 et ceux spectres des composés monoaromatiques étaient que tous les signaux semblaient être dédoublés. Les spectres RMN 1_H, 13_{C, COSY, HSQC ont révélé la}

présence de deux chaînes aliphatiques de cinq carbones, de deux couples de protons aromatiques meta et d’un seul groupement méthoxy.15 _{En se basant sur ces observations}

spectrales, il a été déterminé que le composé devait être un depside qui est formé par la condensation des deux unités monoaromatique (1 et 5).

Figure 27. Ions moléculaires obtenus lors de l’analyse du composé 11 par HRMS

Cette hypothèse a aussi été confirmée par les ions obtenus dans les spectres ESI en mode négatif et positif. Lors de l’ionisation, le depside a d’abord perdu ou gagné un proton pour formés les ions [M-H]- _et[M+H]+_{. Dans les deux modes d’ionisation, le lien ester a été}

facilement clivé lors de l’ionisation, ce qui a mené à des ions chargés correspondant à deux unités monoaromatiques qui constituent l’acide perlatolique.55 _{En mode positif, l’ion}

[M+H-H2O]+ correspondant au composé 5 a été détecté alors qu’en mode négatif, c’est

l’ion [M-H]- _{du composé 0. L’assignation complète de la structure par l’analyse des}

spectres RMN 1_H, 13_{C, HSQC, COSY et HMBC a permis sans ambigüité de déterminer que}

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Composé 1 (FR 12) – Composé 4 (FR18) :

L’élucidation de la structure des composés 1 et 4 n’a pu être effectuée due à la pureté peu élevée des fractions 12 et 18. La spectrométrie de masse haute résolution a tout de même permis d’obtenir les ions moléculaires pour les composés 1 et 4 qui sont respectivement de 316 et 632 m/z. La formule moléculaire C16H12O7 a pu être déterminée pour le composé 1 à

partir des ions [M-H]- _{= 315,0905 m/z et [M+H]}+ _{= 317,1015 m/z. Aucun métabolite}

lichénique ayant cette masse moléculaire n’a été rapporté précédemment pour le genre

Cladonia.