Transition entre régime de forte perturbation et faible perturbation . 84

Para trabalhar com microrganismos em laboratório é necessário dispor de material, meios de cultura e ambiente estéreis. Os dois primeiros requisitos são relativamente fáceis de conseguir. Para satisfazer o último requisito usou-se uma câmara de fluxo laminar vertical (fig. 2.6) que possui um sistema de filtração de ar por membrana, purificando-o e criando assim no seu interior as condições de assepsia necessárias para a preparação e realização das experiências com bactérias.

Figura 2.6 Câmara de fluxo laminar vertical, apresentando algum material usado em bacteriologia

Neste ponto, apresentamos os estudos de susceptibilidade (toxicidade dos compostos nas células bacterianas sem serem irradiadas, ou seja no escuro), e fotoinactivação (toxicidade dos compostos nas células bacterianas sujeitas a irradiação). A técnica laboratorial utilizada para as determinar foi a técnica de inoculação em placa, já abordada aquando da produção de bactérias, mas neste caso em vez de se semear uma colónia, inocula-se a placa com um determinado volume de suspensão bacteriana. Esta técnica permite uma quantificação da actividade biológica dos compostos estudados.

Para ter uma ideia da densidade bacteriana existente na suspensão a usar, determina- se a concentração de bactérias em suspensão pela densidade óptica (DO) a 650 nm, de uma suspensão celular diluída, por aproximação, de modo a obter uma DO igual a 0,7 correspondendo a uma concentração celular de 108-109 (isto é, cerca de 5x108) células/mL.

Assim, para o estudo da susceptibilidade bacteriana (na ausência de luz), uma suspensão de células com uma concentração de aproximadamente 108 células/mL, preparada a partir da anterior, foi incubada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, com diferentes concentrações de derivado porfirínico. Após este pré-tratamento de dez minutos com o derivado porfirínico, semeou-se um determinado volume das diferentes suspensões directamente nas placas (sem irradiação). Este é o controlo no escuro.

Para a fotoinactivação fez-se novamente o mesmo pré-tratamento de dez minutos, e as suspensões bacterianas nas diferentes concentrações de fotossensibilizador foram logo de seguida irradiadas com uma luz branca de intensidade 50 mW/cm2, durante trinta minutos (fig. 2.7), o que corresponde a uma dose total de energia de 90 J/cm2. Só depois da irradiação é que um volume oportuno de cada suspensão foi semeado em placa.

Cabe realçar que o tempo óptimo de irradiação para cada conjunto composto-célula não foi determinado. Uma vez que todos os compostos tinham uma fotoestabilidade semelhante optou-se por usar o mesmo protocolo para todos os ensaios.

Figura 2.7 Fonte de energia usada para irradiar as células na presença de diferentes concentrações de fotossensibilizador.

Assim que as bactérias em estudo se encontravam semeadas nas placas, estas eram deixadas na incubadora durante a noite a 37 ºC. Durante esse período as células viáveis, sobreviventes aos diferentes tratamentos, desenvolveram-se dando origem a colónias visíveis a olho nu.

O teor de microrganismos viáveis foi determinado por contagem das colónias formadas e expresso em “unidades formadoras de colónias” (UFC).32 Se as células microbianas viáveis, não forem demasiadas, e se se encontrarem bem dispersas (sementeira bem executada), cada colónia formada corresponde a uma célula inicial viável, isto é, que sobreviveu ao tratamento só com droga ou com droga e luz (fig. 2.8). No entanto, se a quantidade de colónias for tão elevada que não se consigam distinguir, então não há correspondência entre o número de colónias e o número inicial de microrganismos. Nesse caso, os resultados são definidos como “não contáveis”.

Figura 2.8 Exemplo de placas obtidas após tratamento com diferentes concentrações de fotossensibilizador.

Enquanto que o primeiro estudo permite determinar a sobrevivência celular nas diferentes concentrações de droga e na ausência de irradiação, isto é, a susceptibilidade da bactéria à droga, o segundo dá-nos os resultados de sobrevivência das células viáveis após tratamento fotodinâmico (PDT). A sobrevivência é inversamente proporcional à toxicidade do composto nas células em qualquer dos estudos.

Os ensaios foram repetidos em experiências independentes e realizados sobre as estirpes bacterianas na fase de crescimento exponencial, com pequenas doses de fotossensibilizador e luz, uma vez que numa fase de latência, apenas uma pequena fracção das bactérias seriam mortas.4

É conveniente referir que foram realizados ensaios preliminares que serviram para avaliarmos, de forma rápida, a actividade dos compostos. Além disso, os resultados obtidos permitiram-nos programar diluições e quantidades das diferentes suspensões a semear em placas inteiras, ou seja, determinar o melhor “protocolo” para cada binómio célula-fotossensibilizador. Assim, enquanto que as sementeiras nos primeiros ensaios de fotoinactivação foram realizadas em fracções de placa (fig. 2.8), depois dos resultados preliminares programaram-se sementeiras de modo a ocupar toda a placa de Petri.

Foram também realizados testes de controlo. Para cada suspensão de bactérias de “trabalho” (que não tiveram qualquer contacto com droga) foi determinado, sempre pelo

método de inoculação em placa, o número exacto de bactérias viáveis existente na suspensão inicial, em unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/mL). A DO previamente realizada, é directamente proporcional ao número de células viáveis e não viáveis, enquanto que o método das placas quantifica apenas as células viáveis, como já tivemos oportunidade de escrever.

O efeito da luz sobre cada estirpe bacteriana (controlos com luz), foi determinado irradiando uma suspensão de bactérias com a concentração de trabalho (108 células/mL) durante o mesmo período de tempo (trinta minutos).

A sobrevivência das células bacterianas, nos ensaios anteriores, é apresentada em percentagem relativa ao número de colónias obtidas nos controlos das suspensões de bactérias de “trabalho” (100% de sobrevivência). Os resultados obtidos com os vários fotossensibilizadores nos diferentes testes sobre cada uma das bactérias, são apresentados nos gráficos 2.1a, 2.2a, 2.3a e 2.4a, seguidos dos respectivos resultados de quantificação de fotossensibilizador ligado a cada uma delas (ver ponto 2.3.3). Assim, pode-se confrontar ambos os resultados, para uma melhor análise e discussão dos mesmos.

Os ensaios foram repetidos em experiências independentes, pelo menos duas vezes; o que apresentamos é a média dos resultados obtidos e os seus desvios padrão.

2.3.3 Determinação da quantidade de fotossensibilizador ligado às células