L’implication de protéines G hétérotrimériques ayant été mise en évidence, nous avons dans un premier temps cherché à savoir si l’expression des protéines Gα12 et Gα13, tout
comme celle des protéines jonctionnelles, variait dans les cellules et les tissus mucoviscidosiques. La quantification des ARNm par qPCR a permis de montrer que le niveau d’expression de Gα12 et Gα13 baisse d’~60% et ~50% dans les cellules et les tissus
jonctionnelles, le niveau d’expression des ARNm de Gα12 et Gα13 n’est pas restauré dans les
cellules CFBE-wt, mais diminue de façon encore plus importante (~80% ; Fig. 20A). Ces résultats ont été confirmés au niveau protéique dans les cellules et dans les tissus bronchiques. Nous pouvons en effet observer sur la figure 20B que le niveau d’expression protéique de Gα12 et Gα13 est plus faible dans les cellules CFBE que dans les cellules HBE, et est encore
plus faible dans les cellules CFBE-wt. Nous n’avons pas observé de différence entre les cellules non-épithéliales mucoviscidosiques IB3 et leur équivalent corrigé, les cellules S9, suggérant que ce phénomène est spécifique de l’épithélium (Fig. 20B). De la même manière, la figure 20C montre que les protéines Gα12 et Gα13 sont plus exprimées dans les tissus sains
que dans les tissus mucoviscidosiques.
Figure 20 : Expression des protéines Gα12 et Gα13 dans les cellules et les tissus bronchiques sains et mucoviscidosiques.
A : La quantification des ARNm de Gα12 et Gα13 dans les cellules épithéliales bronchiques et dans les tissus
bronchiques sains ou mucoviscidosiques a été réalisée par PCR quantitative (qPCR). Les valeurs sont rapportées à la valeur des cellules saines et des tissus sains. Moyenne ± S.E (n= 9).
B : Les protéines des cellules IB3, S9, HBE, CFBE et CFBE-wt ont été extraites, et 100 µg ont été déposés par
puits, séparés sur gel de 12%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant les anticorps anti-Gα12 ou anti-Gα13, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL. C : Les protéines de tissus bronchiques sains et mucoviscidosiques ont été extraites, et 100 µg ont été déposés
par puits, séparés sur gel de 12%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant les anticorps anti-Gα12 ou anti-Gα13, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase
Cette différence a également été observée par immunohistochimie sur les échantillons de tissus humains. En effet, l’observation des protéines Gα12 et Gα13 par cette méthode a
révélé une présence plus importante dans les tissus sains que dans les tissus malades (Fig. 21A). Ces résultats montrent par ailleurs la destruction du tissu épithélial dans les cas mucoviscidosiques par rapport aux tissus sains. De plus, nous avons pu constater que la localisation cellulaire de Gα12 et Gα13 est plus membranaire qu’intracellulaire. Cette
observation a été confirmé par des expériences de western-blot réalisées sur différentes fractions obtenues par centrifugation différentielle à partir des cellules HBE et CFBE (Fig. 21B). Les résultats obtenus confirment d’abord la faible expression des protéines Gα12
et Gα13 dans les cellules CFBE par rapport aux HBE, et montrent une présence importante de
ces deux protéines dans la fraction microsomale (Mic) enrichie en réticulum endoplasmique, en membrane plasmique, en endosomes et en vésicules de sécrétion (Fig. 21B). En revanche, aucune présence n’a été détectée au niveau cytoplasmique (Cyt). Ces résultats confirment la présence membranaire des protéines Gα12 et Gα13.
Figure 21 : Expression et localisation des protéines Gα12 et Gα13 dans les tissus bronchiques sains et mucoviscidosiques.
A : Des coupes de tissus bronchiques humains sains ou mucoviscidosiques, exprimant de manière endogène les
protéines Gα12 et Gα13, ont été immuno-marquées indirectement en utilisant l’anti-Gα12 ou l’anti-Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-lapin couplé à la biotine et permettant ainsi la coloration brune grâce à la fixation du complexe ABC et la présence du réactif DAB. L’utilisation des anticorps secondaires seuls est notre contrôle négatif.
B : Les cellules HBE et CFBE ont été utilisées pour réaliser des centrifugations différentielles afin de séparer les
différents compartiments cellulaires (Ny = noyau ; Mito = mitochondrie ; Mic = microsomes ; Rib = ribosomes ; Cyt = cytosol). 100 µg de protéines ont été déposées par puits, séparées sur gel de 12%, électro-transférées sur membrane de nitrocellulose et révélées par immunodétection, en utilisant les anticorps anti-Gα12 ou anti-Gα13,
De plus, nous avons observé que ces deux protéines sont aussi exprimées au niveau nucléaire (probablement une contamination par le RE), dans les mitochondries, et dans les ribosomes (probablement le pool de protéines restant associé aux ribosomes au cours de la synthèse).
3) Interaction avec ZO-1 et E-cad dans les cellules saines
Par la suite, nous avons voulu confirmer, dans nos lignées cellulaires, les données publiées mettant en évidence l’interaction entre les protéines Gα12/13 et les protéines
jonctionnelles E-cad et ZO-1. Pour cela, nous avons tout d’abord réalisé des expériences de colocalisation dans les cellules saines et mucoviscidosiques, puis des expériences de « Proximity Ligation Assay » (PLA) pour confirmer les interactions.
a) Colocalisation
Figure 22 : Colocalisation des protéines Gα12 et Gα13 avec les protéines des jonctions cellulaires.
A : Les cellules HBE, exprimant de manière endogène les protéines E-cad, Gα12 et Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti-E-cad et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour E-cad) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13). L’overlay représente la superposition des couleurs vertes, rouges et bleues (noyau).
B : Les cellules HBE, exprimant de manière endogène les protéines ZO-1, Gα12 et Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti-ZO-1 et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour ZO-1) et
d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13). L’overlay représente la superposition des couleurs vertes, rouges et bleues (noyau).
C : Les cellules CFBE, exprimant de manière endogène les protéines E-cad, Gα12 et Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti-E-cad et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour E-cad) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13). L’overlay représente la superposition des couleurs vertes, rouges et bleues (noyau).
D : Les cellules CFBE, exprimant de manière endogène les protéines ZO-1, Gα12 et Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti-ZO-1 et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour ZO-1) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13). L’overlay représente la superposition des couleurs vertes, rouges et bleues (noyau).
Les images ont été acquises avec un microscope confocal TCS SP2 (Leica) à l’aide d’un objectif 63x et du logiciel Leica confocal software. La colocalisation a également été effectuée grâce au logiciel Leica confocal software.
Grâce aux expériences de colocalisation réalisées sur les cellules HBE et CFBE, nous avons démontré que les protéines Gα12 et Gα13 colocalisent de manière importante avec les
protéines E-cad et ZO-1 dans les cellules HBE (Fig. 22A et 22B) alors que cette colocalisation est quasi-inexistante dans les cellules CFBE (Fig. 22C et 22D). Ces résultats confirment également les précédents en montrant une expression moins importante des protéines Gα12, Gα13, E-cad et ZO-1 dans les cellules CFBE par rapport aux cellules
HBE (Fig. 22).
b) Interaction
Les protéines Gα12 et Gα13 colocalisant avec E-cad et ZO-1 dans nos lignées
cellulaires, nous avons voulu étudier leurs interactions grâce à la méthode PLA, permettant de visualiser des interactions protéiques par microscopie.
Figure 23 : Interaction des protéines Gαααα12 et Gαααα13 avec les protéines jonctionnelles E-cad et ZO 1.
Quantification du nombre de signaux par cellule obtenu par PLA pour les interactions entre les protéines Gα12 et E-cad (A), Gα12 et ZO-1 (B), Gα13 et E-cad (C) et Gα13 et ZO-1 (D). Les images ont été acquises avec un microscope confocal TCS SP2 (Leica) à l’aide d’un objectif 63x et du logiciel Leica confocal software. La quantification a été obtenue par le programme Image J. Moyenne ± S.E (n= 5).
Les résultats montrent que Gα12 et E cad interagissent, et que cette interaction est
moins importante dans les cellules CFBE que dans les cellules HBE et CFBE-wt (Fig. 23A). De même, la protéine Gα12 interagit moins avec ZO-1 dans les cellules malades que dans les
cellules saines ou les cellules corrigées (Fig. 23B). Des résultats très comparables ont été obtenus en ce qui concerne les interactions entre Gα13 et E-cad et entre Gα13 et ZO-1
(Fig. 23C et 23D). Ces résultats suggèrent donc que la baisse du TER dans les cellules mucoviscidosique pourrait non seulement être due à une diminution de l’expression de protéines jonctionnelles, mais également à une diminution de l’interaction entre ces protéines et les protéines Gα12 et Gα13.