70% et 100% des protéines CFTR sauvages et mutées (F508del), respectivement, sont bloquées et dégradées rapidement dans le RE (Varga et al., 2004; Loo et al., 2008). Le fait que les protéines Gα12 et Gα13 soient aussi localisées dans le RE laisse penser que ces deux
protéines peuvent colocaliser avec CFTR dans ce même compartiment. Afin d’apporter une réponse à cette question, nous avons réalisé des expériences d’immunofluorescence et de fractionnement subcellulaire sur gradient discontinue de sucrose.
Pour l’immunofluorescence, nous avons utilisé la lignée cellulaire IB3-1 (Fig. 7A) qui exprime de manière endogène la protéine CFTR-F508del et les protéines Gα12 et Gα13, la
lignée COS-1 et la lignée HEK-293 (Fig. 7C & 7D) qui expriment d’une manière endogène Gα12 et Gα13 et transitoirement CFTR-F508del-HA, et la lignée BHK-21 (Fig. 7B) qui
coexprime stablement la protéine CFTR sauvage étiquetée HA et les protéines Gα12 ou Gα13
étiquetées GFP. Les résultats montrent une parfaite colocalisation, indiquée par la couleur jaune résultant de la superposition des couleurs vertes et rouges, des protéines CFTR sauvages ou mutées avec les protéines Gα12 ou Gα13 (Fig. 7A, 7B, 7C & 7D). Le même résultat a été
obtenu avec les protéines hyperactives ; Gα12QL et Gα13QL (résultats non montrés). En
présence de la protéine CFTR sauvage, nous avons aussi noté une colocalisation entre la forme complexe-glycosylée et les protéines Gα12 ou Gα13,confirmant par la même occasion
la présence de ces deux protéines au niveau de la membrane plasmique (Fig. 7B). Ces résultats montrent aussi que la colocalisation entre la forme core-glycosylée de CFTR sauvage ou mutée et les protéines Gα12 ou Gα13 a lieu dans le RE.
Pour appuyer ce dernier constat, nous avons réalisé des expériences de fractionnement subcellulaire sur gradient discontinue de sucrose.
La différence par rapport à la centrifugation différentielle réside dans la pureté de la fraction réticulaire obtenue. En effet, avec la technique de centrifugation différentielle, la fraction microsomale (Mic) obtenue contient en plus du RE, le Golgi, la membrane plasmique et les vésicules intermédiaires (endosomes et vésicules cargo). En revanche, le fractionnement subcellulaire sur gradient de sucrose permet d’obtenir une fraction riche à 95% en RE.
Ce facteur d’enrichissement a été obtenu par la mesure d’activité enzymatique de marqueur spécifique du RE et par le calcul de rendement par rapport à l’homogénat de départ (De Keukeleire et al., 2008). Cette technique a été utilisée sur les cellules BHK exprimant de
manière stable les protéines CFTR, CFTR-F508del, Gα12 ou Gα13 étiquetées HA. La présence
ou non de ces protéines ainsi que celle de la protéine calnexine (CNX) dans les différentes fractions a été révélée par western-blot (Fig. 7E et 7F).
Figure 7 : Colocalisation de CFTR sauvage et mutée avec les protéines Gαααα12, Gαααα13 et la CNX.
A : Les cellules IB3-1, exprimant de manière stable la protéine CFTR-F508del étiquetée HA et de manière
endogène les protéines Gα12 ou Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti- HA et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour le HA) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13).
B : Les cellules BHK-21, exprimant de manière stable la protéine CFTR-F508del étiquetée HA et les protéines
Gα12 ou Gα13 étiquetées GFP, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti-HA. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé au TRITC (pour le HA), la GFP a été détectée par autofluorescence.
C : Les cellules COS-7, exprimant de manière stable la protéine CFTR-F508del étiquetée HA et de manière
endogène les protéines Gα12 ou Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti- HA et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour le HA) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13).
D : Les cellules HEK-293, exprimant de manière stable la protéine CFTR-F508del étiquetée HA et de manière
endogène les protéines Gα12 ou Gα13, ont été fixées, perméabilisées et marquées indirectement en utilisant l’anti- HA et l’anti-Gα12 ou -Gα13. La révélation de ces anticorps a été obtenue par l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-souris couplé à l’Alexa488 (pour le HA) et d’un anticorps anti-lapin couplé au TRITC (pour Gα12 et Gα13).
Les images ont été acquises avec un microscope à épifluorescence à l’aide d’un objectif 63x à immersion avec un système Zeiss AxioCam MRm et le logiciel AxioVision 4.2. La colocalisation a été effectuée grâce au logiciel Photoshop.
E : Les cellules BHK-21, exprimant de manière stable les protéines CFTR ou Gα12 étiquetées HA, ont été utilisées pour réaliser un fractionnement subcellulaire sur gradient de sucrose. 10 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 7% pour CFTR et 12% pour Gα12, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant les anti-HA et anti-CNX et le kit ECL. La flèche grise correspond à la forme immature et la flèche noire correspond à la forme mature de CFTR.
F : Les cellules BHK-21, exprimant de manière stable les protéines CFTR-F508del ou Gα13 étiquetées HA, ont été utilisées pour réaliser un fractionnement subcellulaire sur gradient de sucrose. 10 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 7% pour CFTR F508del et 12% pour Gα13, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant les anti-HA et anti-CNX et le kit ECL. La flèche grise correspond à la forme immature de CFTR-F508del.
Les résultats montrent que nous avons eu 14 fractions allant de la fraction la plus dense (1) à la fraction la plus légère (14). La caractérisation enzymatique nous a permis d’identifier trois types de fractions. De 1 à 6, il s’agit des fractions réticulaires, les même qui nous ont servi pour identifier par spectrométrie de masse les protéines Gα12 et Gα13. Les
fractions de 7 à 10 qui correspondent aux lysosomes, lieu de dégradation par excellence de la protéine CFTR sauvage et d’une partie de la protéine F508 présente au niveau de la membrane plasmique après correction (Okiyoneda et al., 2010; Barrière et al., 2011). Finalement, les fractions 11-14 correspondent à l’appareil de Golgi, à la membrane plasmique, aux vésicules de sécrétion et aux endosomes (De Keukeleire et al., 2008). Les résultats d’immunodétection, en utilisant les anticorps anti-HA, montrent une distribution des protéines CFTR sauvages et mutées conforme à celle observée en immunofluorescence. Alors que la protéine mutée est présente uniquement au niveau du RE, la protéine CFTR sauvage est présente dans toutes les fractions avec une forme immature exprimée uniquement dans la fraction réticulaire, et une forme mature révélée dans toutes les fractions (Fig. 7E et 7F). La détection des protéines Gα12 et Gα13 montre que ces deux protéines sont exprimées
principalement dans le RE où elles colocalisent avec les protéines CFTR sauvages et mutées. Ce résultat est confirmé par la détection dans les mêmes fractions de la protéine CNX (Fig. 7E et 7F). Nos résultats montrent aussi que les protéines Gα12/Gα13, principalement Gα12,
sont exprimées au niveau de la membrane plasmique.
L’ensemble de ces résultats montre que les protéines Gα12 et Gα13 sont principalement
exprimées dans le RE où elles coexistent avec la forme core-glycosylée de la protéine CFTR sauvage et mutée, et conforte notre hypothèse d’une implication directe ou indirecte de ces protéines dans la dégradation de CFTR.