chaperonnes CNX et HSP
H) Implication de HSP90 et de la CNX dans la voie de dégradation dépendante du GTP
A ce stade de nos résultats, nous pouvons logiquement penser que l’implication de Gα12 dans la dégradation de CFTR-F508del pourrait se faire d’une manière indirecte. En
effet, Gα12 n’interagit pas avec CFTR mutée, mais interagit avec les protéines chaperonnes
qui contrôlent son niveau de repliement et sa dégradation : CNX et HSP90. De plus, la présence d’AlF-4 (inhibiteur des protéines G-hétérotrimériques, dont Gα12), la déplétion en
du pool de protéines qui va s’associer avec HSP90 et CNX) ou de Gα12QL (forme
hyperactive incapable d’échanger rapidement le GTP par le GDP) inhibent la dégradation de CFTR mutée.
L’ensemble de ces données laissent penser que l’interaction de Gα12 avec CNX ou
HSP90 influencerait le pool disponible de ces chaperonnes pouvant interagir avec la protéine CFTR-F508del.
Pour essayer de répondre à toutes ces questions, nous avons entrepris d’étudier l’effet de ces interactions sur Gα12, CNX, HSP90 et CFTR mutée.
1) HSP90 stabilise les protéines Gαααα
12et CFTR-F508del
Nous avons dans un premier temps étudié l’effet d’une déplétion en GTP, par MPA, sur la stabilité de Gα12. Bien que Gα12 soit une GTPase, dont le changement de conformation
nécessaire à son activité est très dépendant du GTP, sa stabilité n’est pas influencée par l’absence du GTP (Fig. 11 A et 11C). Le même résultat a été obtenu en présence de BFA, avec une demi-vie (T1/2~12h) comparable au contrôle (CHX seul) (Fig. 11B et 11C). Le fait
que la demi-vie en présence de BFA soit comparable au contrôle montre que cette protéine est éliminée au niveau du RE. Cependant, en présence de geldanamycine (GA), inhibiteur spécifique de la protéine HSP90, la demi-vie de Gα12 s’effondre pour atteindre ~4h (Fig. 11B
et 11C). HSP90 est une protéine chaperonne du système de dégradation associé au RE, et a pour rôle de s’associer avec les protéines mal repliées, de les aider à se replier et de les accompagner jusqu’à leur lieu de dégradation si le repliement n’a pas pu être achevé (Buchner, 1996; Loo et al., 1998). La protéine CFTR-F508del interagit avec HSP90 et l’inhibition de cette interaction par GA accélére sa dégradation (Fig. 11D). Ce résultat est comprabale à celui publié par l’équipe de Riordan qui montre que la GA inhible la maturation de CFTR sauvage et accélère la dégradation de la forme immature au niveau du RE (Loo et
al., 1998).
Ces résultats montrent donc que la stabilité de Gα12 ne dépend pas de la concentration
en GTP, et qu’elle est dégradée dans le RE. De plus, la protéine chaperonne HSP90 stabilise les protéines Gα12 et CFTR mutée.
Il est donc raisonnable de penser que la déplétion en GTP affecterait HSP90 en contrôlant l’activité, et non la stabilité de Gα12, et que par la suite, HSP90 contrôlerait la
Les mêmes études sont en cours de réalisations pour évaluer l’effet de la castanospermine, inhibiteur spécifique de la calnexine.
Figure 11 : Effet de HSP90 sur la stabilité de Gαααα12, CFTR-F508del et CFTR sauvage.
A : Les cellules BHK exprimant de manière stable Gα12 étiquetée HA ont été incubées en présence de CHX (100 µg/ml) en absence et en présence de MPA (50 µM). 100 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 12%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant l’anticorps anti-HA, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL.
B : Les cellules BHK exprimant de manière stable Gα12 étiquetée HA ont été incubées en présence de CHX (100 µg/ml) en présence de Geldanamycine (GA ; 2 µM) ou de Brefildine A (BFA ; 5 µg/ml). 100 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 12%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant l’anticorps anti-HA, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL.
C : Quantité de CFTR-F508del restante exprimée en pourcentage par rapport à son expression initiale à t=0 en
fonction du temps. La quantification a été obtenue par le programme Image J. Moyenne ± S.E (n= 5).
D : Les cellules BHK exprimant de manière stable CFTR-F508del étiquetée HA ont été incubées en présence de
CHX (100 µg/ml) en absence et en présence de GA (2 µM). 100 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 7%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant l’anticorps anti-HA, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL.
2) Une déplétion en GTP stabilise les protéines HSP90 et CNX
Afin d’étayer cette hypothèse, nous avons évalué le rôle du GTP sur la stabilité des chaperonnes HSP90 et CNX en traitant les cellules BHK-21 avec le MPA. Nos résultats montrent qu’une déplétion en GTP permet de stabiliser HSP90 et la CNX (Fig. 12 A et 12C). En effet, la demi-vie de HSP90 dans les cellules non-traitées est de ~13h30 alors qu’elle est de ~23h dans les cellules traitées par le MPA (Fig. 12B).
Cet effet est encore plus prononcé pour la CNX. La demi-vie de cette chaperonne, de ~19h lorsque les cellules ne sont pas traitées par le MPA, est supérieur à 24h dans des conditions de déplétion en GTP (Fig. 12D).
Figure 12 : Effet du GTP sur la stabilité des protéines HSP90 et CNX.
A : Les cellules BHK ont été incubées en présence de CHX (100 µg/ml) en absence et en présence de MPA
(50 µM). 100 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 9%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant l’anticorps anti-HSP90, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL.
B : Quantité de HSP90 restante exprimée en pourcentage par rapport à son expression initiale à t=0 en fonction
du temps. La quantification a été obtenue par le programme Image J. Moyenne ± S.E (n= 4).
C : Les cellules BHK ont été incubées en présence de CHX (100 µg/ml) en absence et en présence de MPA
(50 µM). 100 µg de protéines ont été déposés par puits, séparés sur gel de 9%, électro-transférés sur membrane de nitrocellulose et révélés par immunodétection, en utilisant l’anticorps anti-CNX, l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase et le kit ECL.
D : Quantité de CNX restante exprimée en pourcentage par rapport à son expression initiale à t=0 en fonction du
temps. La quantification a été obtenue par le programme Image J. Moyenne ± S.E (n= 4).
Ces résultats montrent donc qu’une déplétion en GTP stabilise les protéines chaperonnes HSP90 et CNX. Il est raisonnable de penser que cette stabilisation dépende de l’effet du MPA sur la protéine Gα12.