Immunolocalisation cellulaire

1) Principe général

Dans la technique d’immunofluorescence indirecte, l’immunomarquage permet de localiser un antigène dans un tissu ou dans une cellule à l’aide d’un anticorps spécifique puis un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (Fig. M10). La fluorescence est ensuite détectée à l’aide de microscopie classique ou de microscopie confocale. Dans la technique de fluorescence directe, la protéine d’intérêt est fusionnée à une protéine auto-fluorescente (exemple : la GFP ou le DsRed).

Figure M10 : Principe de l’immunofluorescence indirecte.

2) Protocole d’immunomarquage

Pour les expériences d’immunolocalisation, les cellules étaient cultivées sur des lamelles de 12 mm de diamètre. Les cellules étaient fixées pendant 20 min à TA par la formaline 10%. Après fixation, les cellules étaient perméabilisées avec 0,2% de Triton X-100 pendant 5 min et la lamelle était saturée avec le tampon de blocage (0,5% BSA dans du PBS contenant 0,1 mM Ca2+ et 2 mM Mg2+). L’incubation successive avec l’anticorps primaire

dirigé contre la protéine d’intérêt et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à l’Alexa 488 ou anti-IgG de lapin couplé au TRITC nous a permis de détecter au niveau cellulaire le complexe anticorps-antigène fluorescent par l’utilisation d’un microscope à fluorescence, après montage lamelle/lame en présence de milieu de montage.

3) Microscopie à épifluorescence

L’observation de la fluorescence a été rendue possible grâce à l’utilisation du microscope inversé à fluorescence (Axiovert 200M, Zeiss, France). Ce microscope est équipé d’un jeu de filtres permettant la détection du DAPI (λex= 359nm et λem= 461nm), du FITC (λex=488nm et λem= 530nm), du YFP (λex= 520nm et λem= 532nm) et du TRITC (λex= 544nm et λem= 572nm) et d’une caméra (AxioCam MRm, Zeiss, France) permettant l’acquisition d’images avec l’objectif à immersion 63x (X 63/1,35 Zeiss, France). Les images étaient, par la suite, analysées avec le logiciel AxioVision 4.2 (Zeiss, France).

4) Microscopie confocale

Le microscope confocal, utilisant le laser pour balayer la surface d’intérêt, permet de visualiser, à l’aide de fluorochromes, des protéines au niveau cellulaire et tissulaire. La

technique d’imagerie confocale à fluorescence permet d’obtenir des images de grande résolution grâce à des coupes « optiques » de l’échantillon obtenues par une projection sur l’axe Z. Basée sur l’élimination des signaux de fluorescence provenant des régions situées en dehors du plan focal, cette technique donne ainsi accès à des informations situées à l’intérieur des cellules. Le système disponible au sein de l’institut est un Leica TCS SP2. Il est équipé de deux lasers : un UV et un Argon permettant d’obtenir 8 raies d’excitation (351, 354, 458, 476, 488, 514, 543 et 633 nm), couvrant ainsi tout le spectre d’excitation. L’objectif utilisé était un 63x à immersion.

La sélection de la zone d’intérêt et la mise au point d’approche étaient réalisées en mode épifluorescence. On basculait par la suite en mode confocal pour la mise au point fine qui était réalisée à partir du module de commande du système confocal TCS SP2. Le réglage de la longueur d’onde et de la puissance de la raie laser d’excitation (HeNe/ArKr), le choix du filtre dichroïque et le réglage de la fenêtre d’acquisition et du gain du photomultiplicateur étaient réalisés pour chaque fluorochrome. Une fois ses réglages établis, ils n’étaient plus modifiés au cours de la séance d’acquisition et étaient appliqués à toutes les lignées cellulaires dans un souci de normalisation.

Les prises de vues étaient réalisées par 3 à 5 balayages unidirectionnels successifs à la vitesse de 400 Hz qui étaient moyennés afin de diminuer le bruit de fond électronique. Le mode séquentiel était employé lorsqu’il y avait plusieurs fluorochromes.

L’acquisition de la fluorescence et la reconstitution des images ont été données par le logiciel contrôlant le système : Leica confocal software (Leica, France).

B) Immunohistochimie

L’immunohistochimie (IHC) est réalisée sur tissus fixés montés sur lame et repose sur la détection du peptide ou de la protéine qui va être reconnue par un anticorps spécifique. Cet anticorps est lui-même reconnu par un anticorps secondaire couplé à une enzyme (la peroxidase dans notre cas).

La révélation se fait alors à l’aide du substrat de l’enzyme (diaminobenzidine pour la peroxidase).

Nous avions utilisé des anticorps primaire, anti-Gα12 et anti-Gα13 humain développés

chez le lapin. L’anticorps secondaire utilisé était l’anticorps biotinylé anti-lapin, qui se fixe sur l’anticorps primaire. A ce complexe, nous avions rajouté les protéines : avidine, biotine et peroxidase qui vont permettre à la fois une amplification du signal et une détection des sites

d’expression et ce, après addition du substrat de l’enzyme peroxidase, le DiAminoBenzidine (DAB). Ce substrat chromogène va traduire une réaction positive par une coloration marron aux sites d’expression de la protéine recherchée. Le principe est illustré figure M11.

Figure M11 : Principe de l’immunohistochimie.

Brièvement, à partir des coupes de paraffine, nous réalisons une étape de déparaffination qui consiste en une succession de bains. Le premier est un bain de xylène, suivi d’alcool 100%, d’alcool 90%, d’alcool 70% et enfin d’alcool 50%.

Les coupes sont ensuite placées dans un mélange de 3,5 ml d’H2O2 30% complété à

100 ml avec du méthanol pendant 30 minutes, étape nécessaire pour inhiber les peroxydases endogènes présentes dans le tissu.

Les sites non spécifiques sont ensuite bloqués pendant 1 heure avec du sérum normal de chèvre (NGS) : 120 µl de NGS complétés à 10 ml avec du PBS 1X (Phosphate Buffer Solution).

L’anticorps primaire : anti-Gα12 ou anti-Gα13 humain dilué au 1/100 dans du PBS 1X

est alors rajouté et reste au contact des sections tissulaires pendant toute une nuit à 4°C. Le lendemain, 2 rinçages au PBS 1X sont effectués avant de rajouter pendant 2 heures l’anticorps biotinylé dilué au 1/250. Deux lavages au PBS 1X sont effectués et le tissu est incubé avec le complexe avidine-biotine-peroxidase pendant deux heures.

Deux derniers lavages au PBS 1X sont réalisés avant la révélation de la réaction finale suite à l’addition substrat DAB.

Enfin, nous faisons un contre marquage pendant 1 minute à l’hématoxyline de Carrazzi, qui colore les noyaux en bleu.

Finalement, nous procédons à l’étape de déshydratation qui consiste à refaire plusieurs bains croissants d’alcool (50%, 70%, 90%, 100%) puis de xylène avant de les monter avec le milieu de montage pour microscopie.