II. Matériel et méthodes
9. Tests d’activité biologique
9.1. Activité anti-radicalaire vis-à-vis du DPPH de la carnosine et de son dérivé acylé
La capacité à piéger le radical DPPH (2,2-diphényl-1-picryl-hydrazyl) de la carnosine et de son dérivé acylé a été évaluée selon le protocole décrit dans la littérature (Brand-Williams et al., 1995). 50 µL de solution méthanolique à différentes concentrations de composé à tester sont ajoutés à 1,95 mL de solution méthanolique de DPPH à 6 × 10–5 M. Les mélanges sont alors agités vigoureusement et placés à l’obscurité à température ambiante pendant 30 mn. L’absorbance à 517 nm est alors mesurée par spectrophotomètre. Toutes les mesures sont réalisées trois fois. Un contrôle négatif est nécessaire pour ce test et correspond à l’échantillon sans composé à tester. La capacité à piéger le radical DPPH est calculée par l’équation suivante :
DPPH activité anti-radicalaire (%) = (1 - DO517échantillon / DO517controle) x 100
La concentration inhibitrice est exprimée en fonction de la concentration de composé puis modélisée par régression linéaire afin de déterminer la CI50 (concentration nécessaire pour piéger 50 % des radicaux DPPH) des composés testés. Pour interpréter ces résultats, un composé de référence est utilisé : le Trolox dont la concentration (CI50) nécessaire pour piéger 50 % du radical DPPH est de 11 µM.
9.2. Activité inhibitrice de la carnosine et de son dérivé acylé envers la xanthine oxydase
Ce test d’activité est réalisé d’après la procédure décrite dans la littérature (Cos et al.,
1998). 2 mL de mélange réactionnel contenant 200 mM de tampon phosphate à pH 7,8, 0,2 mM d’hydroxylamine, 50 µM de xanthine, 0,1 mM d’EDTA (pH 7.0) sont préparés. La réaction est débutée par ajout de l’enzyme (7,5 mU/mL) dans le mélange avec la carnosine ou son dérivé acylé (25 – 300 µM). Un contrôle négatif en absence de produit à tester est utilisé comme référence. Après incubation à 37 °C pendant 30 mn, la réaction est stoppée par ajout de 200 µL d’HCl (0,58 M). L’activité résiduelle de l’enzyme est déterminée en fonction de la présence d’acide urique libéré, mesurée par spectrophotomètre à 290 nm. Pour chaque composé et à chaque concentration testée, le pourcentage d’inhibition de l’enzyme est déterminé d’après l’équation suivante :
Xanthine oxydase inhibition (%) = (1 – DO290échantillon / DO290controle) x 100 La concentration inhibitrice est exprimée en fonction de la concentration de l’échantillon puis modélisée par un modèle polynomial de second ordre afin de déterminer CI50 (concentration nécessaire pour inhiber 50 % de l’activité de la xanthine oxydase dans ce système) de chaque composé testé. L’allopurinol est utilisé comme référence dans cette étude et présente une CI50 de 2,4 µM.
9.3. Capacité de la carnosine et de son dérivé acylé à piéger le radical super oxyde
Après les mesures décrites précédemment, les milieux réactionnels sont récupérés et supplémentés en un mélange d’acide sulfinimique (300 µg/mL), de N-(1-naphtyl)-éthylènediamine dihydrochloride (5 µg/mL) et d’acide acétique (16,7 % v/v). Chaque tube est alors placé à l’obscurité à température ambiante pendant 30 mn. La capacité de la carnosine et de son dérivé acylé à piéger le radical super oxyde est mesurée par spectrophotomètre à 550 nm. Pour chaque composé et à chaque concentration testée, le pourcentage de piégeage de l’anion superoxyde est déterminé d’après l’équation suivante :
capacité à piéger O2- (%) = (1 - DO550échantillon / DO550contrôle) x 100
L’activité de piégeage de l’anion superoxyde est exprimée en fonction de la concentration de l’échantillon puis modélisée par régression linéaire afin de déterminer la CI50 de chaque
2 , , ) exp ( nm n m m n xcal x J =
∑ ∑
−(concentration nécessaire pour piéger 50 % des anions superoxydes dans ce système) de 3,3 µM.
10. Modélisation des cinétiques de bioconversion par MatLab
La modélisation de cinétiques de réactions a nécessité la construction d’un programme informatique à l’aide d’un logiciel d’intégration Matlab (Matwork® soft). Matlab est un langage de programmation dédié au calcul scientifique. Il tire son nom, de sa grande simplicité à réaliser du calcul matriciel (Matrix Laboratory). Initialement développé pour les automaticiens, il propose aujourd’hui des dizaines de boîtes à outils d’optimisation (Toolbox) permettant d’aborder des problèmes plus variés telles que la résolution d’équations différentielles traduisant un mécanisme réactionnel.
La modélisation de cinétiques de réaction implique l’optimisation d’un ensemble de paramètres (constantes cinétiques et/ou d’équilibre) à partir de la minimisation d’une fonction objectif J, laquelle en ce cas est la somme des carrés des différences entre les données simulées et les valeurs expérimentales des concentrations des composants au cours du temps :
Les concentrations simulées des composants sont obtenues grâce à l’intégration numérique de l’ensemble d’équations différentielles de vitesse de formation ou de disparition. Le travail d’optimisation peut se décomposer en deux étapes : une étude analytique, avec l’élection du mécanisme de réaction, et une étude numérique, avec les outils d’optimisation de Matlab, visant à déterminer le profil de commande optimal du modèle ajusté sur les données expérimentales. Pour réaliser l’optimisation d’un modèle on peut utiliser différents algorithmes, les deux principaux algorithmes sont présentés ci-dessous.
- La fonction fminsearch, pour l’optimisation non contrainte et sans limite sur les variables.
Elle fait partie de la boîte à outils d’optimisation de ce logiciel (Matlab Optimization Toolbox). Cette fonction utilise l’algorithme de Mead (ou « simplexe de Nelder-Mead »). Une interprétation intuitive de cet algorithme est qu’une direction de recherche est définie par le plus mauvais point (celui dont la fonction coût est la plus élevée) et le barycentre des sommets hormis le plus mauvais. Le simplexe peut accélérer (expansion) ou décélérer (contraction) dans cette direction pour localiser une région et zoomer (rétrécissement) vers l’optimum.
Cette méthode Neder-Mead est capable de distordre le simplexe pour mieux s’adapter à la topologie de la fonction. Ceci lui confère, à la fois, une force et une faiblesse : il gagne en vitesse de convergence, mais perd en robustesse.
- L’algorithme génétique : méthode évolutionnaire qui est souvent présentée par analogie avec la théorie de la sélection naturelle de Darwin (Perrin 1997 ; Muniglia et al.,
2004).
Les individus les plus performants d’une population ont une plus grande probabilité de survivre et de se reproduire, en donnant des descendants encore mieux adaptés.
La correspondance avec la minimisation d’une fonction est la suivante : un « individu » est un point x, « la population » est un ensemble de points et « la performance d’un individu x » est évalué par sa valeur de fonction objectif J(x). En partant d’un échantillonnage de l’espace de recherche (population initiale), cette méthode réalise des tirages de nouvelles populations (des « générations ») à l’aide d’opérations de sélection, croissement et mutation. Ce dernier a été utilisé pour établir un modèle cinétique décrivant précisément les cinétiques de trans-acylation du 6-amino-1-hexanol en solvant organique biocatalysée par Novozym 435®.