Techniques d’analyse structurale

8.1. Spectroscopie infrarouge

Dans cette étude, l’état d’ionisation des substrats (6-amino-1-hexanol et acide oléique) a été étudié par spectroscopie infrarouge dans le domaine du moyen infrarouge (MIR : 4000 cm-1 à 400 cm-1).

8.1.1. Descriptif du matériel

Pour cette étude, un spectromètre à transformée de Fourier de type Tensor 27 (Brücker, Allemagne) a été utilisé. Il est constitué de quatre éléments : une source, un interféromètre de Michelson (figure II.13.), un système de présentation de l’échantillon thermostaté (55 °C) et un détecteur de type MCT (monocristal en alliage de mercure, cadmium et tellure) ; l’ensemble du système est purgé en permanence sous un flux d’air sec, afin de limiter les bruits de fond dus à la vapeur d’eau atmosphérique.

Figure II.13. Interféromètre de Michelson.

Le détecteur utilisé est un détecteur MCT constitué d’un monocristal en alliage de mercure cadmium tellure déposé sur un support inerte. Les spectres des solvants (2-méthyl-2-butanol ou hexane) et des échantillons (acide oléique solubilisé dans le solvant organique avec ou sans 6-amino-1-hexanol et prélèvements réactionnels) sont réalisés en effectuant 64 scans à une résolution de 4 cm^-1. La cellule sur laquelle sont déposés les échantillons est une cellule à réflexion totale atténuée (ATR) constituée d’un cristal de sélénure de zinc. La surface de ce matériau présente un indice de réfraction élevé, on parle d’élément IRE (internal reflection element) (figure II.14.).

Figure II.14. Cellule ATR. Représentation schématique.

Séparatrice

Radiation infrarouge

Cristal ATR

Echantillon ^{Enveloppe thermostatée}

Radiation infrarouge

Cristal ATR

Dans un premier temps, des spectres de référence du 2-méthyl-2-butanol et de l’hexane ont été réalisés pour ensuite être soustraits à tous les autres spectres.

Pour étudier la formation du complexe ionique entre le substrat aminé et l’acide oléique, les spectres des solutions suivantes ont été réalisés :

- acide oléique solubilisé dans le 2-méthyl-2-butanol et dans l’hexane,

- mélanges de substrat aminé et d’acide oléique, à différents rapports molaires, dans le 2-méthyl-2-butanol et dans l’hexane,

- prélèvements de la réaction d’acylation du 6-amino-1-hexanol par l’acide oléique dans le 2-méthyl-2-butanol et dans l’hexane.

8.1.2. Traitement spectral

Le traitement spectral indiqué ci-dessous a été effectué pour l’ensemble des spectres obtenus au cours de cette étude.

La correction de la ligne de base, entre des pics voire entre plusieurs spectres, est une fonction induisant une homogénéisation de cette ligne, favorisant ainsi la comparaison. Les spectres obtenus ont été soumis à ce traitement sur 200 points.

Le lissage est une fonction basée sur l’algorithme de Savitzky-Golay permettant de diminuer le bruitage d’un spectre et donc de le lisser. Le nombre de point de lissage est modulable mais peut, lorsqu’il est trop important, fausser l’intensité du signal et induire une perte d’informations. Dans cette étude, le nombre de points de lissage est de 13.

La normalisation consiste à relier le minimum de signal à 0 et le maximum à une autre valeur. Tous les spectres ont été soumis à une normalisation vectorielle.

8.2. Spectrométrie de masse

8.2.1. Analyse en mode infusion directe et couplage CL-SM

Dans cette étude, deux spectromètres de masse on été utilisés : le SCIEX API 150EX (Perkin Elmer) et le LTQ (Thermo electron corporation^®, E.U.) avec une source d’ionisation de type ESI (electrospray ionisation). Dans ce mode, les molécules sont protonées ou déprotonées, avec la possibilité de former des adduits sodium et/ou potassium. Ces deux spectromètres de masse ont été employés en mode infusion directe. Dans ce cas l’échantillon

injecté à l’aide d’une microseringue à débit constant dans la source (5 µL/mn). La température du capillaire est fixée à 150 °C et la tension à 5 kV. Un exemple de spectre de masse obtenu par infusion directe est présenté figure II.15.

Figure II.15. Spectre de masse du N-oléyl Lys-Ser obtenu en mode positif électrospray par infusion directe du composé purifié et resolubilisé dans un mélange eau/méthanol (50/50 v/v). 498,7 g.mol-1 : M + H+ (N-oléyl Lys-Ser), 520,7 g.mol-1 : M + Na+ (N-oléyl Lys-Ser).

Un second mode d’analyse a été utilisé : le couplage CL/SM. Les composés de l’échantillon analysé subissent une première séparation (cf méthode CLHP décrite ci-dessus) avant d’être introduits dans le spectromètre de masse. Ainsi, à chaque pic chromatographique peut être associé un spectre de masse permettant d’identifier la molécule (figure II.16.)

Figure II.16. Analyse CL-SM du milieu réactionnel d’acylation enzymatique de la carnosine. (a)

Chromatogramme UV (214 nm). (b) Chromatogramme ionique simple (SIC) fixé à m/z [490-492 g.mol-1]. (c)

Spectre de masse du pic présentant un temps de rétention de 7,10 mn.

(a)

(c) (b)

8.2.2. Analyse en mode fragmentation

Le spectromètre de masse LTQ (Thermo electron corporation®, E.U.) a été utilisé en mode fragmentation pour déterminer précisément la structure des produits purifiés. On parle alors de SMn, n étant le nombre de niveaux de fragmentation imposé à un ion d’intérêt. Les éléments constitutifs d’un spectromètre de masse par fragmentation sont présentés sur la figure II.17.

Figure II.17. Eléments constitutifs d’un spectromètre de masse à fragmentation. Représentation schématique de la chambre de collision.

Ce spectromètre de masse comporte deux analyseurs. Un premier analyseur capable de sélectionner l’ion d’intérêt. Celui-ci se retrouve ainsi purifié du mélange injecté qui peut être très complexe. L’ion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision .Un deuxième analyseur mesure alors les valeurs m/z des fragments, on parle alors de SM-SM (spectrométrie de masse en tandem). Si on répète l’opération, on fait de la SM-SM-SM ou SM³. Pour ces analyses, la température du capillaire est fixée à 300 °C et la tension à 5kV. L’identification des ions fils obtenus est réalisée à l’aide du logiciel d’identification structurale Xcalibur^® soft (THERMO).

8.3. Résonance magnétique nucléaire

Les spectres RMN du proton 1H et du carbone 13C ont été effectués pour les composés suivants : O-oléyl aminohexanol, le N,O-dioléyl aminohexanol et le N-oléyl Lys-Ser. Avant analyse, les produits sont solubilisés soit dans du chloroforme deutéré (CDCl₃) soit du diméthylsufoxyde deutéré (DMSO). Le spectromètre utilisé est un Brücker 300 MHz, 7,1 T (Germany).