Les milieux fondus

Figure I.20. Relation entre l’hydrophobie du solvant, la température et le taux de conversion du substrat relative à la synthèse de Nε-oléyl lysine biocatalysée par Lypozyme® d’après Soo et al., (2004).

Ainsi, les auteurs ont suggéré que les conditions optimales de synthèse de ce dérivé acylé de lysine nécessitent une mise en œuvre du procédé dans l’hexane, une concentration en enzyme de 62 g/L, des concentrations en substrat et donneur d’acyle respectivement de 33 mM et 99 mM et une température de 57 °C pour obtenir un rendement optimal de 33 % après 96 h (Soo

et al., 2004).

5.2. Les milieux fondus.

Les exigences environnementales concernant la synthèse de biomolécules à intérêt thérapeutique, agroalimentaire et cosmétologique, encouragent le développement de procédés enzymatiques d’acylation en milieux fondus (Hobbs et al., 2007 ; Lancaster 2008).

5.2.1. Généralités

Un milieu fondu consiste à substituer un solvant organique classiquement utilisé pour l’acylation enzymatique par un excès de donneur d’acyle jouant à la fois le rôle de substrat et de solvant. De tels procédés permettent donc de s’affranchir de l’utilisation de solvants organiques classiques et, la présence d’un excès de donneur d’acyle, permet de déplacer l’équilibre thermodynamique de la réaction, catalysée généralement par des lipases, vers la synthèse. La majorité des études concernant les réactions enzymatiques en milieu fondu décrivent des bioconversions de type estérification et amidification. Un tel procédé est par exemple utilisé pour la synthèse de biodiesel par acylation enzymatique du méthanol par de l’huile de soja. Cependant, ce procédé « vert » ne permet pas de concurrencer la synthèse de biodiesel en solvant organique (Ha et al., 2007). Un autre exemple d’application développé par la société royale de Chimie (The Royal Society of Chemistry©) est l’utilisation de ce

procédé pour la synthèse d’ester de citronnelle catalysée par Novozyme 435^® (Lozano et al.,

2007b). Une étude concernant la synthèse d’oléate de butyle par trans-estérification en système sans solvant constitué d’huile de tournesol, catalysée par Lipozym® a mis en évidence une activité synthétique en faveur de la production d’ester de butyle de 60 % contre 95 % en solvant organique (Dossat et al., 2002). Une autre étude a récemment démontré l’intérêt écologique de ce genre de milieu pour la synthèse de dérivé acylé d’alkanolamine proche des structures de céramides à intérêt cosmétologique et alimentaire (Couturier et al.,

2008).

5.2.2. Mise en œuvre de réactions d’acylation en milieux fondus

La mise en œuvre de réactions en milieu fondu présente différents inconvénients susceptibles d’affecter son efficacité. En effet, lorsque le donneur d’acyle est un acide gras libre, étant donné sa quantité importante, la synthèse de dérivés acylés va libérer une quantité significative de molécules d’eau pouvant augmenter l’a_w du milieu réactionnel et, ainsi, inciter la réaction inverse : l’hydrolyse. Une alternative à cet inconvénient est la mise en œuvre de la réaction sous vide de façon à éliminer au fur à mesure de la réaction les molécules d’eau libérées et ainsi favoriser la synthèse. Un tel procédé a fait ses preuves dans divers travaux tels que la résolution racémique d’alcools secondaires par acylation catalysée par CAL B en milieu fondu à une pression de 5 mm de mercure (Irimescu et al., 2003). Plusieurs auteurs ont mis en avant dans leurs études le problème de la formation de complexe paire d’ions entre l’acide gras en excès et le substrat aminé susceptible d’être protoné. Il est suggéré que ce complexe ionique peut affecter le rendement de la réaction en atténuant la disponibilité des substrats (Irimescu et al., 2004b ; Tufvesson et al., 2007). Lors de l’acylation en milieu fondu de l’éthanolamine, le complexe ionique formé étant peu soluble, affecte le rendement de la réaction. La figure I.21. représente les performances cinétiques du procédé qui a été mis en œuvre pour palier cette limitation.

Figure I.21. Courbes cinétiques relatives à l’acylation de l’éthanolamine catalysée par Novozym 435® dans l’acide laurique. Les pointillés représentent l’ajout séquentiel en deux temps de l’éthanolamine. (□) acide laurique, (∆) amide-ester et (○) amide d’après Tufvesson et al., (2007).

Pour résoudre ce problème, les auteurs ont appliqué le procédé suivant :

- une mise en œuvre de la réaction sous vide avec la moitié de la quantité de substrat prévue permettant la synthèse de composé N-acylé et N,O-diacylé,

- l’ajout de l’autre moitié de substrat à acyler avec une remise à pression atmosphérique par arrêt de la pompe à vide car le substrat ajouté n’ayant pas le temps de se complexer à l’acide gras, reste très volatile,

- l’hydrolyse du composé N,O-diacylé en composé N-acylé.

De cette façon les auteurs sont parvenus à un taux de conversion du substrat en 10 h de 85 % en orientant la chimio-sélectivité de la réaction en faveur de l’amide à hauteur de 85 % (Tufvesson et al., 2007).

Il apparaît clairement que la mise en œuvre de procédés enzymatiques de N-acylation en milieu fondu est une bonne alternative respectueuse de l’environnement mais nécessite la connaissance et la maîtrise de plusieurs phénomènes tels que la formation possible d’un complexe ionique en milieux organiques et un transfert d’acyle potentiel pour des molécules de type alcool-aminé. Il est également important de tenir compte de la nature des substrats à convertir à l’origine de leur solubilité et de leur volatilité dans le milieu réactionnel.

5.2.3. Maintien et orientation de la sélectivité.

Les milieux fondus permettent à l’enzyme de conserver, voire d’améliorer certaines de ces caractéristiques telles que son énantio-sélectivité. Des études concernant la N-acylation ont ainsi été réalisées dans ce genre de système. Citons par exemple la résolution racémique d’amines primaires par N-acylation biocatalysée par des lipases. Le schéma réactionnel est présenté sur la figure I.22.

Figure I.22. N-acylation énantiosélective d’amine primaire catalysée par une lipase en milieu fondu d’après Irimescu et al., (2004b).

Dans cette réaction, la lipase B de Candida antarctica immobilisée permet de catalyser préférentiellement la N-acylation énantio-sélective de la phényléthylamine. 97 % de l’amide synthétisée provient de l’énantiomère R avec un taux de conversion de substrat de 34 % (Irimescu et al., 2004). Cette énantio-sélectivité en faveur des amines de configuration R en milieu fondu de la lipase B de Candida antarctica a également été mise en évidence dans d’autres réactions de N-acylation comme le présente la figure I.23.

Figure I.23. N-acylation enantiosélective d’amine primaire catalysée par CALB en milieu fondu d’après Prasad et al., (2005).

Par ailleurs, une étude concernant l’acylation de phloridzine, molécule polyfonctionnelle, en milieu fondu, catalysée par Novozym 435^® a été réalisée. Les résultats obtenus mettaient en

évidence la régio-sélectivité exclusive de cette lipase en faveur de la position 6’’-O du substrat (Enaud et al., 2004).