Ce sujet a fait l’objet d’une revue par le laboratoire (annexe).
3.3.1
Description du TALEN.
Le TALEN est composé du domaine de liaison à l’ADN des TALE (Transcription Activator Like-Effector) fusionnés aux domaines endonucléasiques FokI. Les TALE ont été découverts chez les phytopathogènes du genre Xanthomonas, ce sont des facteurs de virulence qui agissent comme les activateurs de la transcription, figure 24.
Figure 24: Structure des TALEN. A. Les TALE sont des facteurs de transcription, ils sont constitués de répétitions de 33 à 35 acides aminés. Les acides aminés 12 et 13 sont hypervariables et reconnaissent spécifiquement un nucléotide. B. Association d’un TALE au niveau de la séquence cible d’ADN. Chaque demi-site est lié à un hétérodimère de FokI. Lorsque les deux demi-sites reconnaissent leur cible, FokI est dimérisée et coupe le double brin d’ADN. Adaptée de Dupret et al. 2014
Les TALE se lient à l’ADN via la partie centrale des répétitions qui le composent. Les répétitions sont composées de 33 à 35 acides aminés. Les acides aminés 12 et 13 sont hypervariables et permettent l’interaction avec l’ADN via la reconnaissance spécifique d’une seule paire de base. Chaque répétition est composée de deux hélices
α et d’une boucle contenant les deux acides aminés variables, figure 25 (Deng et al.
2012b). L’acide aminé 12 permet de stabiliser la liaison du TALE à l’ADN alors que l’acide aminé 13 reconnaît spécifiquement le nucléotide par une liaison de van der Waals ou une liaison hydrogène (Mak et al. 2012). Les di-résidus variables NI, HD, NK/NH, NN et NG reconnaissent respectivement A, C, G, G/A et T, table 5 (Boch et al. 2009).
L’utilisation de NN pour reconnaître le nucléotide G peut influencer positivement l’activité du TALEN mais pour plus de spécificité pour la guanine, il est préférable d’utiliser NK ou NH (Streubel et al. 2012). NH a une forte spécificité de reconnais- sance de la guanine dans le génome des mammifères (Cong et al. 2012). La présence d’une base T en position 0 est importante pour l’activité et la liaison stable du
Figure 25: Liaison du RVD à l’ADN. Les TALE sont composés de répétitions qui se lient à l’ADN via deux acides aminés hypervariables, les 12 et 13 qui forment le RVD (répétition variable de dirésidus). Adaptée de Kim et al. 2014.
Di-résidus variables Nucléotides
NI A
HD C
NK/NH G
NN G/A
NG T
Table 5: Reconnaissance des nucléotides par les di-résidus variables du TALE.
TALE (Doyle et al. 2013). La liaison des TALEN est sensible à la méthylation de l’ADN au niveau des cytosines. L’utilisation des di-résidus HN ou NG à la place de HD permet au TALEN de se lier à l’ADN méthylé (Valton et al. 2012, Deng et al. 2012a).
Les TALE reconnaissent efficacement l’ADN et peuvent induire des cassures d’ADN double brin lorsqu’ils sont fusionnés à FokI. FokI est une endonucléase qui agit sous forme de dimère. Chaque dimère est lié à un TALE ciblant la séquence cible d’ADN, figure 24. Les cassures d’ADN double brin pourront être réparées par jonction des extrémités non homologues (NHEJ) ou répération par homologie (HR) (Miller et al. 2011). La réparation des cassures d’ADN double brin permet l’insertion de mutations aléatoires ou dirigées. L’efficacité du TALEN est améliorée lorsque 12 à 15 paires de bases séparent les sites de liaison des deux TALEN. Les TALEN peuvent se lier
au niveau de sites aspécifiques, de off-target et créer des mutations additionnelles (Mussolino et al. 2011).
3.3.2
Assemblage des TALEN.
Les TALEN sont composés de nombreuses séquences répétitives ce qui complique leur assemblage. Plusieurs méthodes ont été développées :
— Cermak et al. 2011, ont dévéloppé l’assemblage des TALEN par la méthode du Golden Gate. Cette méthode est rapide et peu coûteuse, permet d’assembler jusqu’a 31 modules via deux étapes de clonage, figure 26A.
— La liaison des différents modules peut également être réalisée par des cycles de digestion-ligation grâce à l’ajout d’extrémités uniques (Li et al. 2011, Mor- bitzer et al. 2011, Li et al. 2012), figure 26B.
— La méthode ICA (Iterative Capped Assembly), les monomères sont ajoutés individuellement par ligation ; la construction est couplée à la biotyne liée à une bille magnétique couverte de streptavidine.
— Un système de capping (ajout d’oligonucléotides qui bloquent les assemblages incomplets) permet l’assemblage de 21 monomères en 3 heures (Briggs et al. 2012).
— La technique de l’assemblage FLASH (Fast Ligation base Automatable Solid- phase High-throughput) permet d’assembler les TALEN de manière automa- tique. Les répétitions sont assemblées sous forme de monomère, dimère, tri- mère ou tétramère et sont assemblées par ligation ; la construction est liée à une biotine (Reyon et al. 2012), figure 26C.
— L’assemblage LIC (Ligation-Independant Cloning) permet la liaison des ré- pétitions en absence de ligation et peut être automatisée. Des extrémités complémentaires sont créées en utilisant l’activité exonucléase de la T4 en absence de nucléotides. La longueur des extrémités permet aux différents fragments de former un ADN circulaire (Schmid-Burgk et al. 2013).
Figure 26: Les différentes méthodes d’assemblage des TALEN. A. Le Golden gate permet d’assembler les différentes répétitions grâce aux extrémités cohésives différentes créées par les enzymes de restriction de type IIS B. Assemblage des unités par ligations successives et l’ajout d’extrémités uniques. C. FLASH permet d’assembler les TALEN de manière automatique par ligation (Figure de Dupret et al. 2014).
3.3.3
Edition des génomes.
Afin de concevoir des TALEN spécifiques et n’ayant pas de off-target, des ou- tils ont été développés comme E-TALEN (http ://www.e-talen.org) (Heigwer et al. 2013) et le logiciel TALENoffer (Grau et al. 2013). Les TALEN permettent d’éditer les génomes facilement et rapidement in vivo en injectant l’ARNm des TALEN chez les embryons. L’injection des TALEN dans le cytoplasme des zygotes de cochon, permet de développer des mutants mono-allélique ou bi-allélique (Carlson et al. 2012). L’injection de deux couples de TALEN chez le poisson zèbre pour cibler deux
sites distaux sur le même chromosome, permet de créer des délétions et inversions dans le génome d’une centaine à un millier de paires de bases (Xiao et al. 2013). Les TALEN peuvent également être utilisés pour insérer des séquences d’ADN. La méthode Obligare utilise l’efficacité de la réparation via NHEJ pour insérer 15kb dans des cellules humaines. La séquence cible du génome (où l’on souhaite insérer une séquence d’ADN) et celle du vecteur donneur sont coupées par l’endonucléase. Par ce système, des extrémités complémentaires sont créées et vont permettre la réparation par insertion du vecteur donneur (Maresca et al. 2013). L’insertion de sé- quences spécifiques peut également être réalisée par réparation par homologie. Chez le poisson zèbre au stade une cellule, l’ARNm des TALEN est co-injecté avec un ADN double brin donneur contenant des séquences homologues pour la recombinai- son ; la longueur des séquences homologues influence l’efficacité de la recombinaison homologue.