Hématoxyline-Eosine. Les lames sont déparaffinées 5 min dans le claral et dans un bain de 5 min 50% claral-50% ethanol, puis réhydratées par un bain de 5 min dans 100% éthanol, 1 min dans 70% éthanol et finalement un bain dans l’eau du robinet. Puis les noyaux sont colorés 1 min à l’hématoxyline. Cette solution est rincée avec l’eau du robinet 4 fois 5 min, la coloration est fixée par un bain de 1 min dans 100% éthanol. Les lames sont rincées à l’eau du robinet rapidement puis colorées 1 min avec l’éosine. La coloration est rincée par l’eau du robinet 2 fois 5 min. Les lames sont déshydratées par un bain de 1 min 70% éthanol, 95% éthanol, 50% claral-50%
éthanol et 100% éthanol. Finalement les lames sont séchées 15 min à température ambiante puis les lamelles sont montées avec le milieu Duolink (DUO80102, Sigma).
Immunomarquage. Les coupes sont déparaffinées pendant 1h à 60˚C puis avec 2 bains de 5 min dans le claral. Puis les lames sont réhydratées progressivement par des bains successifs de 5 min dans 50%claral-50%éthanol, 2 fois 100% éthanol, 2 fois 70% éthanol puis 30% éthanol et finalement 3 fois dans l’eau. Les antigènes sont activés grâce à un tampon citrate (8mM de citrate de sodium et 1mM d’acide citrique dans de l’eau) pendant 20 min à 95˚C. La fluorescence aspécifique du PFA est supprimée en lavant les lames 3 fois 5 min dans 100mM glycine. Puis les sites aspécifiques sont bloqués en incubant les lames 30 min à température ambiante dans 5%BSA dans le TBST (TBS (Tris Buffered Saline)-0.1%Tween 20). L’anticorps primaire est incubé toute la nuit à 4˚C, 150µL sont déposés par lame, l’anticorps anti-phalloidin (Alexa 594, A12381, ThermoFisher) est dilué au 1/100 ; l’anticorps anti-actine (A2066, Sigma) est dilué au 1/50. Le lendemain l’excès est lavé par 4 bains de 5 min dans le TBST puis les lames sont contre-colorées par le Hoechst 33285 à 1mM pendant 30 min. Le colorant est lavé par 2 bains de 5 min de PBS. Finalement les lamelles sont montées avec le milieu Dako (Fluorescent mounting medium S3023) et du vernis à ongles. Les lames sont stockées à l’abri de la lumière et à 4˚C.
Hybridation in situ.
Jour 1. Le premier jour, les lames sont déparaffinées deux fois 5 min dans le claral puis réhydratées par 2 bains de 1 min dans 100% éthanol et par 1 bain de 1 min dans 70% éthanol. Ensuite les lames sont lavées 5 min avec 2X SSPE (20X SSPE : 175.3g NaCl, 27.6g NaH2PO4, 7.4g EDTA, pH 7.4, qsp 1L eau distillée) puis refixées 20 min dans 4% PFA et rincées à nouveau 5 min avec 2X SSPE. Les tissus sont perméabilisés avec la protéinase K (3µg/mL dans le PBS) à 37˚pendant 30 min. Les lames sont ensuite incubées 15 min dans 0,2N HCl et rincées avec 2X SSPE. La sonde marquée à la digoxygénine est incubée toute la nuit à 70˚C à une concentration
de 300ng dans 300µL de tampon d’hybridation (1X solution salée (1X : 0.2M NaCl, 10mM Tris HCl pH9.5, 5 mM NaH2PO4 , 5 mM Na2HPO4, 1 mM Tris Base, 5mM EDTA qsp 1L), 50% formamide déionisé (Sigma), 10% dextran sulphate (Sigma), 1mg/mL ARNt (stock 50mg/mL)(Sigma), 1X Denhardt (100X Denhardt : 2g BSA (Sigma), 2g ficoll (Sigma) , 2g polyvinylpyrolidone (Sigma), qsp 100 mL)). La lame est recouverte d’une lamelle et mise en chambre humide afin d’éviter l’évaporation.
Jour 2. Le deuxième jour, les lamelles sont retirées par un bain de 15min dans la solution A (50% formamide, 1X SSC, 0.1% tween) à 65˚C, puis l’excès de sonde est lavé par 2 bains de 30 min dans la solution A à 65˚C et 2 bains de 30 min dans le TBST à température ambiante. Les sites aspécifiques sont bloqués 3h30 à température ambiante par la solution de blocage (10% serum de veau dans le TBST) en chambre humide. L’anticorps est dilué au 1/10000 et incubé toute la nuit à 4˚C puis recouvert d’une lamelle.
Jour 3. Le troisième jour, la lamelle est retirée grâce à un bain de 20 min dans le TBST puis l’anticorps est lavé par 3 bains de 20 min. Le pH des tissus est ajusté par 2 lavages de 10 min dans le tampon Tris-alcalin (100mM Tris HCL pH9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% tween). La coloration par les substrats NBT et BCIP (22,5 mg/L NBT, 17,5mg/L BCIP dans du tampon Tris-Alcalin) est réalisée à l’abri de la lumière et est réalisée en 24h à 5 jours.
Jour 4. Le dernier jour, lorsque la coloration est terminée, elle est arrêtée par 4 bains de 10 min dans le PBST et fixée dans 4% PFA 2h à température ambiante. Les lames sont rincées à l’eau rapidement et elles sont séchées 15 min à température ambiante. Le tissu est déshydraté par un bain de 1 min dans 70% éthanol, 1 bain de 10 min dans 100% éthanol suivi d’un bain de 1 min et finalement un bain de 3 min dans le claral. Les lames sont séchées une nouvelle fois 15 min à température ambiante. La lamelle est montée avec le milieu de montage Duolink (Sigma).
Test de mort cellulaire, kit Roche 11 684 817 910. Les lames sont déparaf- finées en chauffant 1h à 60˚C dans le four d’hybridation puis, les coupes sont placés 2 fois 5 min dans le Claral, 5 min dans 50% éthanol-50% claral, 2 fois 5 min 100% éthanol, 2 fois 5 min 70% éthanol, 5 min dans 30% éthanol et finalement 3 fois 5 min dans l’eau. Les tissus sont perméabilisés grâce à la protéinase K (3µg/mL diluée dans le PBS) et recouverte d’une lamelle pendant 30 min à 37˚C, en chambre hu- mide. Pour le contrôle positif, une lame est incubée 10 min à température ambiante avec 3U/mL DNAseI, 50mM Tris HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 1mg/mL BSA. Pour le
contrôle négatif, l’expérience est réalisée en absence de l’enzyme (sans la solution 1 du kit).
Pour la réaction enzymatique les solutions 1 et 2 sont mélangées. Afin de recouvrir la totalité des coupes présentent sur la lame, un volume de 300µL est nécessaire. Dans un souci d’économie du kit, ce mélange est dilué 5 fois dans du PBST. Une lamelle est déposée afin d’éviter l’évaporation et de permettre une bonne répartition du liquide. La réaction a lieu à 37˚C pendant 1h en chambre humide.
Les lames sont lavées 3 fois 5 min dans le PBS afin de faire tomber les lamelles et de laver l’excédant de la solution enzymatique. Ensuite les lames sont couvertes de la solution 3 (POD converter) diluée 3 fois afin de pouvoir recouvrir les échantillons avec 150µL. Les lames sont recouvertes d’une lamelle et la réaction a lieu pendant 30 min à 37˚C en chambre humide.
Les lames sont lavées à nouveau 3 fois 5 min dans le PBS. Le marquage est révélé grâce au DAB (Coloration de la peroxidase : diaminobenzidine tablets D4168-50 SET), les lames sont recouvertes d’une lamelle afin de pouvoir suivre la coloration sous la loupe sans perde de solution. La coloration est arrêtée après 45 min à tem- pérature ambiante.
La solution est arrêtée avec 3 lavages de 5 min dans le PBS. Les échantillons sont déshydratés afin de monter la lamelle par un bain de 1 min dans 70% d’éthanol, 10 min dans 100% éthanol puis 1 min dans 100% éthanol. Finalement les lames sont placées en milieu hydrophobe par un bain de 3 min dans le claral. Les lames sont séchées pendant 15 min à température ambiante sous la sorbonne puis la lamelle est
montée à l’aide du milieu de montage Duolink mounting medium.