Lors du développement précoce, les mutants pcgf1-/- présentent un retard de dé-
veloppement mais les adultes ont un phénotype de vieillissement accéléré. En effet, à l’âge d’un an, les adultes pcgf1-/- ont un phénotype de poisson observé chez des
individus beaucoup plus âgés, aux alentours de 3 ans. Ces adultes ont une cour- bure de la colonne vertébrale significativement plus accentuée, une peau plus fine et semble plus mince. Ainsi, l’inactivation de pcgf1 cause un vieillissement accéléré. Le
fait que les embryons aient un retard de développement et que les adultes vieillissent prématurément nous laisse penser que Pcgf1 joue un rôle dans la mise à disposition des cellules souches nécessaires au développement embryonnaire et au renouvellement des tissus âgés.
Li et al. 2013a, mettent en évidence le rôle de Pcgf1 dans la régulation de l’expression de Oct4 en se liant directement à son promoteur (-1021 à -784). Les protéines NA- NOG, OCT4 (marqueurs de cellules souches), PATZ1 (régulation transcriptionelle et modelage de la chromatine) et DPPA4 (régulateur impliqué dans le développe- ment) intéragissent avec PCGF1. Cette dernière régule positivement l’expression de NANOG et DPPA1 de façon directe ou indirecte. Ainsi, PCGF1 est impliquée dans la pluripotence des cellules souches. Celle-ci est fortement exprimée dans les cellules souches des gliomes et joue un rôle dans leur auto-renouvellement, la formation des neurosphères et l’expression des marqueurs de cellules souches (NESTIN, CD133 et SOX2). Elle réprime l’expression de RDH16 (répresseur de cellules souches, impli- qué dans la synthèse de l’acide rétinoïque), en se fixant directement à son promoteur (-1073 à -823) (Hu et al. 2017b).
PCGF1 régule positivement les facteurs impliqués dans la différenciation de l’ec- toderme et du mésoderme. Elle joue un rôle dans le devenir des cellules souches. L’inactivation de Pcgf1 dans les cellules embryonnaires souches (ES) n’a pas d’effet sur l’auto-renouvellement cellulaire mais retarde leur différenciation. En effet, les corps embryoïdes (permettant d’étudier la différenciation des cellules souches pour obtenir les 3 feuillets) sont plus petits dû à un retard de différenciation cellulaire. Les corps embryoïdes formés de cellules Pcgf1-/- expriment plus fortement les mar-
queurs de pluripotence (OCT4, NANOG) mais expriment peu les marqueurs de différenciation de l’ectoderme (FGF5, NESTIN) et du mésoderme (FLK1). Ainsi, Yan et al. 2017, mettent en évidence le rôle de PCGF1 dans la différenciation des cellules souches. Ces résultats confirment le rôle que Pcgf1 pourrait avoir dans la mobilisation des cellules souches dans différents tissus aux stades embryonnaires et lors du vieillissement afin de renouveler les tissus.
Ces auteurs montrent également que l’abondance de la marque H2AK119ub1 n’est pas altérée lorsque Pcgf1 est inactivée dans les cellules ES tout comme dans notre modèle in vivo. Ainsi, la perte de Pcgf1 pourrait être compensée par un homologue, en particulier Pcgf5. Si et al. 2016a, mettent en évidence que PCGF5 est exprimée dans les cellules souches hématopoiétiques et les progéniteurs multipotents. Son in-
activation ne cause pas d’anomalie dans l’hématopoïèse. Les deux homologues PCGF les plus exprimés dans les cellules souches hématopoïètiques sont PCGF1 et PCGF5. Il se pourrait dans ce modèle que PCGF1 compense la perte de PCGF5. Ainsi, la
viabilité de nos mutants et l’absence de baisse de la marque H2AK119ub1 pourraient être dues à une compensation de Pcgf1 par un homologue. Les
cellules souches sont indispensables au renouvellement des tissus durant toute la vie de l’organisme. L’arrêt de prolifération des cellules souches particulièrement via les voies p21 et p16 entraîne la sénescence (Oh et al. 2014, LaPak et al. 2014). En
conclusion, les résultats obtenus montrent l’importance de Pcgf1 dans la mobilisation des cellules souches tant lors du développement précoce que lors du vieillissement afin de générer les tissus. Les homologues de Pcgf1 peuvent compenser sa perte et permettre de conserver la marque H2AK119ub1.
Perspectives. Yan et al. 2017, montrent le rôle de PCGF1 non pas dans le renou- vellement des cellules souches mais dans leur différenciation. Lors de prochaines ana- lyses il serait intéressant d’étudier l’expression des facteurs de pluripotence comme Oct4, Sox2 et Nanog chez les larves et les adultes mais également les marqueurs de différenciation des 3 feuillets chez les embryons (endoderme, mésoderme et ecto- derme). Chez les adultes il serait important de visualiser la différenciation des cellules souches au niveau de tissus très prolifératifs comme l’intestin et également lors de la régénération de la nageoire caudale. Même si la nageoire caudale est capable de régénérer (data non montrées), la différenciation des cellules du mésenchyme est peut-être affectée. Pcgf1 peut être compensée par d’autres Pcgf, par hybridation
in situ nous pourrions étudier leur expression et ainsi connaître quel homologue
Chapitre 2
Ezh2
Au laboratoire nous avons mis en place un modèle d’inactivation d’ezh2 chez le poisson zèbre grâce aux TALEN. L’exon deux a été choisi comme cible du TA- LEN. Le site de restriction DdeI situé dans la région spacer du TALEN permet de génotyper les individus. La mutation obtenue est l’insertion de 22 nucléotides (une délétion de 5 nucléotides et une insertion de 27 nucléotides). Celle-ci cause un dé- calage de la phase ouverte de lecture et la formation d’un codon stop. Les poissons expriment une protéine Ezh2 tronquée de 60 acides aminés. Cette protéine tronquée n’est composée d’aucun domaine conservé. Les poissons hétérozygotes mutants pour cette mutation sont viables et fertiles tandis que les homozygotes mutants meurent à 12 jpf mais ne présentent pas de phénotype macroscopique. Afin de comprendre la raison de la mort de ces larves j’ai réalisé plusieurs expériences. L’analyse du phéno- type cranio-facial (coloration des muscles et des cartilages) n’a pas révélé d’anomalie de développement ni de mise en place de l’axe antéro-postérieur.
2.1
Expression au cours du développement.
Par hybridation in situ, nous avons mis en évidence que l’ARN maternel d’ezh2 est exprimé chez les embryons au stade 2-4 cellules. Et par RT-PCR nous avons mis en évidence que la mère dépose principalement l’ARN maternel sauvage dans
les oeufs. A 24 hpf, l’expression d’ezh2 chez les individus ezh2+/+ se trouve majori-
tairement dans la tête, les yeux et au niveau de la queue mais est absente chez les individus ezh2-/-. A 96 hpf, ezh2 est exprimé au niveau de l’intestin. Par RT-PCR
nous avons mis en évidence que l’expression d’ezh2 diminue au cours du dévelop- pement ; l’expression est plus abondante à 3 jpf qu’à 9 jpf. La digestion du produit PCR par DdeI indique qu’à 3 jpf le transcrit mutant est présent ; il n’est pas to- talement dégradé par le système NMD (Nonsense-Mediated Decay). Ainsi, l’ARN mutant est soumis en partie au mécanisme de dégradation des ARN non sens. Cela pourrait être dû au fait qu’il n’existe pas de jonction exon-exon qui permette de reconnaître cet ARN comme anormal (Brogna et al. 2009, Hug et al. 2016). L’ex- pression de la protéine Ezh2 n’est pas détectée par immunofluorescence à 3 jpf. A partir de 9 jpf l’absence de la protéine Ezh2 cause une diminution de 70% de la marque H3K27me3. La mortalité des larves est associée à cette baisse. Lors des divisions cellulaires la marque H3K27me3 recrute le complexe PRC2 et permet le maintien de la marque épigénétique. Le recrutement du complexe PRC2 permet de maintenir la répression des gènes cibles. Si Ezh2 est absente alors cette marque est diluée au cours des divisions ; ce qui explique une légère baisse de H3K27me3 chez les individus ezh2+/-et une forte baisse chez les ezh2-/-(Hansen et al. 2008). La faible
baisse de la marque H3K27me3 chez les larves ezh2+/- n’est pas associée à la mort
des larves ; alors qu’une plus forte baisse de l’abondance de la marque H3K27me3 est associée à la mort des larves ezh2-/-. Il semble qu’il existe un seuil de perte de la
marque K3K27me3 au delà duquel la perte de la marque est mortelle.
Perspectives. L’analyse de larves entières nous montre que la perte de H3K27me3 est globale dans toute la larve, cependant cette perte n’est pas totale. Il serait intéressant d’étudier l’abondance de la marque H3K27me3 dans des structures plus fines comme la base des plis de l’intestin ; de visualiser l’abondance de cette marque au niveau des zones contenant les cellules souches et tout au long de la villosité lors de la différenciation sur des coupes d’embryon et de larve. Par western blot il serait intéressant d’extraire les histones de façon tissu spécifique. Grâce à la dissection et
la micro-dissection (Picker et al. 2009, Burns et al. 2006), nous pourrions réaliser les extractions à partir des tissus disséqués et mettre en évidence l’abondance de la marque H3K27me3.