Préparation des embryons pour l’hybridation in situ. Le bon développe- ment des œufs collectés est contrôlé visuellement à l’aide d’une loupe binoculaire. Les œufs sont placés dans des boîtes de pétri en présence de milieu E2 (875 mg/L NaCl ; 37,5 mg/L KCl ; 120 mg/L MgSO4; 20,5 mg/L KH2PO4; 6 mg/L Na2HPO4;
145 mg/L CaCl2; 60 mg/L NaHCO3) à 28,5˚C jusqu’au stade de développement
souhaité. Les oeufs sont déchorionés par incubation 1 min en présence de pronase (P6911, sigma) 1% préchauffé à 28,5˚C. Les embryons sont alors fixés par du pa- raformaldéhyde (PFA) (Sigma) 4% dans le PBS (phosphate buffer saline, pH7,2) à 4˚C pendant 24 h. Les embryons sont ensuite déshydratés dans du méthanol (100%) 15 min à température ambiante avant d’être conservés à -20˚C.
Préparation des nageoires caudales en régénération pour l’hybridation in
situ. Quatre jours après l’amputation (jpa), les poissons sont euthanasiés selon les recommandations en vigueur, par une surdose de tricaïne (0,03%). La nageoire caudale en régénération est prélevée et fixée par du paraformaldéhyde 4% dans le PBS à 4˚C toute la nuit. Les nageoires caudales sont ensuite déshydratées dans du méthanol 15 min à température ambiante avant d’être conservées à -20˚C.
Synthèse des sondes pour l’hybridation in situ. Pour l’hybridation in situ, des sondes ARN contenant un nucléotide marqué à la digoxygénine (DIG) sont syn- thétisées in vitro. L’ADNc préalablement cloné dans le vecteur pSPT18-GW est placé entre les promoteurs SP6 en 5’ et T7 en 3’. L’utilisation du promoteur SP6 permet de générer une sonde contrôle sens alors que le promoteur T7 est utilisé pour générer la sonde test antisens. Avant synthèse de la sonde, 1 µg de plasmide doit être linéarisé par 5 U d’enzyme de restriction (HindIII pour la sonde antisens, XbaI pour la sonde contrôle sens) pendant au moins 1 heure à 37˚C. L’efficacité de la linéarisation des plasmides, est évaluée par électrophorèse en gel d’agarose à 1% dans du TAE (Tris-Acétate, 40 mM EDTA 1mM) en présence de BET (Pro- mega). Avant de synthétiser les sondes, il est nécessaire d’éliminer les enzymes de restriction présentes avec les plasmides linéarisés. Pour cela, le kit MiniElute Gel Extration (Qiagen) est utilisé suivant les instructions du fabricant. La synthèse de la sonde ARN est effectuée à l’aide du kit DIG RNA Labeling SP6/T7 (Roche), en suivant les instructions du fabricant et en utilisant l’ARN polymérase T7 pour générer la sonde antisens ou en utilisant l’ARN polymérase SP6 pour générer la sonde sens, à partir des plasmides. Le kit contient un des nucléotides marqués à
la digoxygénine, l’uridine-5’-triphosphate digoxigénine, permettant ainsi la synthèse d’une sonde marquée qui pourra être reconnue par un anticorps anti-digoxygénine. Après synthèse de la sonde à 37˚C pendant 2 h, cette dernière est purifiée à l’aide du kit RNeasy Mini (Qiagen) selon les instructions du fabricant. La sonde ARN est éluée dans 40 µL et sa concentration est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop Multiskan Go Thermo. Un volume égal de formamide déionisée (Sigma) est ajouté afin de protéger la sonde avant son stockage à -20˚C. La qualité de la sonde est évaluée par électrophorèse en gel d’agarose à 2% dans du TAE (40 mM Tris-Acétate ; 1mM EDTA, pH8,3) en présence de BET (Promega). La synthèse de la sonde et sa purification s’effectuent dans des conditions qui évitent la contami- nation par les RNases (utilisation d’eau traitée au DEPC, nettoyage des plans de travail avec la solution RNase AWAY).
Hybridation in situ sur embryons entiers et nageoires caudales de poisson zèbre. Le protocole d’hybridation in situ est dérivé du protocole décrit par Thisse et Thisse, 2008, et suit plusieurs étapes. Les embryons et échantillons de nageoires caudales, placés dans de petits paniers, sont d’abord progressivement réhydratés par des lavages de 5 min dans des solutions à concentration décroissante (75% [vol/vol], 50%, 25%) de méthanol dans du PBS 1x, suivis par quatre lavages de 5 min dans du PBS - 0,1% Tween 20 (PBST). Les embryons sont ensuite perméabilisés dans un bain de Protéinase K (10 µg/mL). La durée d’incubation dépend de la nature de l’échantillon :
— Stade 1-cellule : 30 secondes — Stade 2-cellules : 30 secondes
— 24 heures après fécondation : 10 minutes — 48 heures après fécondation : 30 minutes — Nageoire caudale de la larve : 10 min — Nageoire caudale adulte : 40 minutes
La réaction est arrêtée par incubation 20 min dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS. Quatre nouveaux lavages de 5 min dans le PBST sont réalisés avant
d’incuber les embryons 5h à 70˚C dans 700 µL de tampon d’hybridation [50% for- mamide déionisé, 5x SSC (solution saline de citrate de sodium ; 150 mM NaCl ; 15 mM Na3Citrate.2H2O), 0,1% Tween 20, ajusté à pH6,0 avec de l’acide citrique 1M] auxquels sont ajoutés 50 µg/mL d’héparine (Sigma) et 500 µg/mL d’ARNt (R7876, Sigma). Le tampon d’hybridation est remplacé par 200 µL de tampon d’hybridation contenant 200 ng de la sonde d’ARN marquée. L’hybridation se déroule sur la nuit à 70˚C. Une série de lavages de 10 min à 70˚C est réalisée dans les solutions suivantes : 75% (vol/vol) tampon d’hybridation (TH) dans 2x SSC, 50% TH dans 2x SSC, 25% TH dans 2x SSC puis 100% TH dans 2x SSC. Les échantillons sont ensuite placés, 2 fois 30 min à 70˚C dans une solution de 0,2x SSC puis 4 autres lavages sont effec- tués, 10 min par lavage, à température ambiante : 75% (vol/vol) 0.2x SSC dans le PBST, 50% 0,2x SSC dans le PBST, 25% 0,2x SSC dans le PBST et 100% PBST. Les embryons sont ensuite incubés dans du tampon de saturation (1x PBST, 2% sérum de mouton, 2 mg/mL BSA) pour une durée de 4 h à température ambiante et sous agitation (balance horizontale). Enfin les embryons sont placés dans une solu- tion contenant l’anticorps anti-digoxigénine (DIG) couplé à la phosphatase alcaline (Roche – 150 U, dilution 1/10000), une nuit à 4˚C sous agitation horizontale. La solution d’anticorps est enlevée. Un bref lavage dans du PBST est réalisé. Six bains de 15 min sont réalisés dans du PBST à température ambiante sous agitation. Le maximum de PBST est enlevé à l’aide d’un papier absorbant. Trois rinçages de 5 min dans du tampon Tris-Alcalin (100 mM Tris-HCl pH9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) à température ambiante sous agitation sont effectués. Le tampon Tris-Alcalin est remplacé par 700 µL pour les embryons, ou 2,1 mL pour les nageoires caudales, de solution de coloration (22,5 mg/L NBT, 17,5mg/L BCIP dans du tampon Tris-Alcalin) révélant les zones marquées par l’anticorps anti-DIG. L’évolution de la coloration est suivie sous une loupe binoculaire et peut apparaître après 15 min à 21 h. La réaction est stoppée une fois que l’intensité de coloration désirée est atteinte. Trois bains de 15 min sont effectués dans la solution Stop (1x PBS pH5,5 ; 1 mM EDTA ; 0,1% Tween 20), à température ambiante, avec agitation à l’abri de la lumière. Les embryons sont enfin transférés dans une boîte de pétri
contenant du glycérol 70% toute la nuit.