Taille des protéiplexes

Afin de vérifier si le retard de migration de l’ADNp était dû à l’agrégation des protéiplexes, la taille des protéiplexes a été déterminée par DLS. Le plasmide pTT/GFP a été mélangé avec la protéine HMGB1ab après leur dilution séparément dans l’eau, au ratio massique ADNp:HMGB1ab de 1:5; les protéiplexes ainsi formés ont un diamètre de 553 ± 73 nm (Figure V-32). Il est à noter que le temps nécessaire pour déterminer la taille des protéiplexes est d’environ 2,5 min, afin de collecter suffisamment de données pour permettre une mesure précise. Nous avons observé qu’entre le début et la fin de la mesure le diamètre moyen avait augmenté de plus de 50 %, indiquant que ceux-ci s’agrègent et une incubation supplémentaire de 5 min a abouti à la formation de complexes dont le diamètre était supérieur à 2 µm. L’utilisation du DPBS comme milieu de complexation à la place de l’eau permet la formation de nanoparticules de 111 ± 5 nm de diamètre, après 15 min et nous n’avons pas observé d’augmentation du diamètre des nanoparticules lors d’une incubation prolongée à 30 min. La taille moyenne et l’indice de polydispersion ont de ce fait été déterminés dans le DPBS comme milieu de complexation.

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Figure V-32. Influence du milieu de complexation sur la taille des protéiplexes.

Le plasmide pTT/GFP et la protéine HMGB1ab ont été dilués séparément dans l’eau (gauche) ou dans le DPBS (droite), ensuite les dilutions ont été mélangées, puis incubées 15 min avant que leurs tailles moyennes soient déterminées par DLS. Chaque courbe correspondant à une détermination.

La figure V-33 représente les diamètres et les indices de polydispersion des protéiplexes formés dans du DPBS avec HMGB1ab et HMGB1ab-E5. L’incubation de 1 µg de pTT/GFP avec 1 µg d’HMGB1ab résulte en la formation de protéiplexes de 139 ± 8 nm (Figure V-33 A), avec la présence d’agrégats représentant moins de 2 % de l’intensité de fluorescence recueillie. Lorsque la quantité d’HMGB1ab pour former les protéiplexes est augmentée à 5, 10 ou 20 µg par µg d’ADNp, aucun agrégat n’a été détecté, leur diamètre se situe entre 103 et 116 nm et leur indice de polydispersion est de 0,177 à 0,227 (Figure V-33 C). Ces résultats indiquent qu’une quantité de 5 à 20 µg d’HMGB1ab permet la formation de nanoparticules ayant des diamètres très similaires, avec un faible effet de la quantité de protéines ajoutée et que les complexes contenus dans la population de particule ont une taille plutôt homogène.

Les protéiplexes formés avec la protéine HMGB1ab fusionnée avec le coil E5 à son extrémité C-terminale ont un diamètre d’environ 150 nm, quelle que soit la quantité de protéines ajoutée (entre 1 et 20 µg, Figure V-33 B). Comme pour HMGB1ab, les protéiplexes formés au ratio massique ADNp:HMGB1ab-E5 égal à 1:1 contiennent des agrégats qui possèdent un diamètre moyen de 4,2 µm. Des nanoparticules dont le diamètre se situe entre 39 et 55 nm sont également présents, lorsque les protéiplexes ont été formés aux ratios ADNp:HMGB1ab-E5 entre 1:1 et 1:10. La fusion d’HMGB1ab

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avec E5 augmente la polydispersion des protéiplexes, en effet leur PdI est de 0,177 à 0,227 pour les protéiplexes formés avec HMGB1ab alors qu’il est de 0,304 à 0,456 lorsque HMGB1ab-E5 a été utilisé. Ces résultats montrent que l’addition du Ecoil à l’extrémité C-ter d’HMGB1ab diminue sa force d’interaction avec l’ADNp, en accord avec ceux montrés dans la figure V-31.

Figure V-33. Taille des protéiplexes formés avec HMGB1ab avec et sans E5.

Le plasmide pTT/GFP et la protéine HMGB1ab (A et C) ou HMGB1ab-E5 (B et D) ont été dilués séparément dans du DPBS, puis les dilutions ont été mélangées et incubées 15 min avant que les tailles moyennes des particules formées (A et B) et leur indice de polydispersion (C et D) soient déterminés par DLS. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes obtenues sur trois échantillons. § indique la présence d’agrégats dans l’échantillon dont la taille est située entre 4,6 et 5,4 µm de diamètre (représentant toujours moins de 2 % de l’intensité totale recueillie). Les nombres présents au-dessus des bâtons indiquent la taille de complexes de plus petite taille présents dans les échantillons et retrouvés lors des trois mesures. Seules les valeur-p significatives ont été indiquées, * valeur-p < 0,05 et ** valeur-p < 0,01.

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La taille moyenne et la polydispersion des protéiplexes formés avec HMGB1 dans sa version complète avec ou sans E5 ont également été déterminées par DLS, pour les ratios massiques ADNp:HMGB1 allant de 1:1 à 1:20 (Figure V-34). L’ajout d’HMGB1 ne permet pas d’obtenir une population de particules de taille homogène, rendant l’interprétation des données de DLS difficile (Figure V-34 A et C). En effet, pour tous les ratios massiques étudiés, on dénote la présence d’agrégats dont la taille se situe entre 5 et 5,4 µm de diamètre, de nanoparticules dont le diamètre est strictement inférieur à 90 nm et d’une troisième population de particules de plusieurs centaines de nanomètres. Cette dernière population de particules, présente en solution lors de la formation des protéiplexes avec 1 à 10 µg d’HMGB1 par µg d’ADNp, possède un diamètre d’environ 200 nm et un indice de polydispersion situé entre 0,385 et 0,416. L’augmentation de la quantité d’HMGB1 à 20 µg résulte en la formation de particules de taille inférieure (333 nm) et de polydispersion supérieure (PdI égal à 0,605). Ces résultats suggèrent que les protéiplexes formés avec HMGB1 ne permettent pas la formation d’une population de particules homogènes et stables, ils corroborent donc les résultats obtenus dans la figure V-8.

L’effet de la fusion du E5 à l’extrémité C-ter d’HMGB1 sur la taille des nanoparticules formées avec l’ADNp a également été évalué (Figure V-34 B et D). De manière similaire à la protéine HMGB1 sans Ecoil, la complexation de l’ADNp avec HMGB1-E5 résulte en la formation d’agrégats et de petites particules, ces dernières ayant un diamètre maximal de 21 nm. Les particules de taille intermédiaires ont un diamètre de 350 nm lorsque celles-ci sont formées au ratio massique pTT/GFP:HMGB1-E5 égal à 1:1 et un PdI de 0,454. L’augmentation de la quantité d’HMGB1-E5 entre 5 et 20 µg par µg d’ADNp permet une réduction de leur taille et de leur indice de polydispersion à environ 300 nm de diamètre et 0,3 respectivement. Globalement la présence du coil E5 sur HMGB1 entraine une augmentation de la taille des protéiplexes et une diminution de leur polydispersion, comparativement à la protéine HMGB1 sans Ecoil.

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Une meilleure interprétation des diamètres des protéiplexes déterminés par DLS pourrait être obtenue grâce à la visualisation des nanoparticules par microscopie électronique ou par microscopie à force atomique, car la mesure de la taille des nanoparticules par DLS est basée sur la supposition que celles-ci ont une forme sphérique. En effet, si les protéiplexes formés avec HMGB1ab-E5, HMGB1 et HMGB1-E5 étaient sous forme de filaments les deux populations de diamètres situés aux alentours de 50 et 150 nm correspondraient respectivement à la largeur et la longueur des nanoparticules.

Figure V-34. Taille des protéiplexes formés avec HMGB1 avec et sans E5.

Le plasmide pTT/GFP et la protéine HMGB1 (A et C) ou HMGB1-E5 (B et D) ont été dilués séparément dans du DPBS, puis les dilutions ont été mélangées, et enfin incubées 15 min avant que les tailles moyennes des particules formées (A et B) et leur indice de polydispersion (C et D) soient déterminés par DLS. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes obtenues sur trois échantillons. § indique la présence d’agrégats dans l’échantillon dont la taille est située entre 4,6 et 5,4 µm de diamètre (représentant toujours moins de 2 % de l’intensité totale recueillie). Les nombres présents au-dessus des bâtons indiquent la taille de complexes de plus petite taille présents dans les échantillons et retrouvés lors des trois mesures. Seules les valeur-p significatives ont été indiquées, * valeur-p < 0,05 et ** valeur-p < 0,01.

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