Influence du ratio massique et de la quantité de protéiplexes sur

Il a déjà été démontré plusieurs fois que lors de l’utilisation de protéines à des fins de transfection, l’augmentation de la quantité de protéines pour former les protéiplexes (c’est-à-dire du ratio massique ADNp:protéine) permettait d’augmenter l’expression du transgène. Toutefois, une quantité trop élevée de protéines pourrait inhiber la capture des protéiplexes, du fait de la présence de protéines libres qui entreraient en compétition avec les protéiplexes pour leurs sites de liaison à la surface cellulaire. Dans cette partie, nous avons voulu évaluer si le faible pourcentage de cellules ayant capturé les protéiplexes et exprimant le transgène pourrait être dû à un ratio massique ADNp:HMGB1-E5 trop faible ou encore à une limitation de la quantité du nombre de protéiplexes. L’augmentation de la quantité d’HMGB1-E5 (mais avec une quantité d’ADNp fixe) pour former les protéiplexes peut aboutir à l’augmentation de la quantité de protéines HMGB1-E5 liée avec l’ADNp (Figure V-20 A, gauche) ou à la formation d’un plus grand nombre de protéiplexes mais ceux-ci contenant moins d’ADNp (Figure V-20 A, droite). Lors de l’augmentation de la quantité de protéiplexes formés avec un même ratio massique ADNp:HMGB1-E5, la quantité d’ADNp pour transfecter un nombre identique de cellules est augmentée (Figure V-20 B).

Figure V-20. Illustration du principe de l’augmentation de la quantité de protéines (A) ou de protéiplexes (B).

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Avant d’évaluer l’impact de l’augmentation de la quantité de protéines pour former les protéiplexes ou la quantité de protéiplexes sur la transfection ciblée, nous avons évalué l’impact de ces augmentations sur la transfection non ciblée. Les cellules mixK5 ont été transfectées avec des protéiplexes formés avec pTT/BFP et HMGB1 sans le Ecoil, puis l’expression de la BFP a été déterminée 2 jpt par cytométrie en flux. Les résultats représentés dans la figure V-21 sont issus de deux expériences indépendantes réalisées en triplicata et les résultats sont représentés en expression relative du transgène. Le pourcentage de cellules 293/K5-CD4-GFP exprimant la BFP obtenu après leur transfection avec des protéiplexes dont le ratio massique pTT/BFP:HMGB1 est égal à 1:5 (avec une quantité de 1 µg d’ADNp par mL de cellules) étant notre valeur de référence. Les cellules ont été transfectées avec des quantités croissantes d’HMGB1 pour former les protéiplexes (Figure V-21 A et B) ou avec des quantités croissantes de protéiplexes (Figure V-21 C et D) et ont été traitées 30 minpt avec 100 µM de chloroquine.

Dans le cas de la transfection non ciblée des cellules mixK5 avec des protéiplexes formés avec HMGB1, le nombre de cellules exprimant le transgène est augmenté proportionnellement avec l’augmentation de la quantité d’HMGB1 pour former les protéiplexes et l’augmentation de la quantité de protéiplexes et ce indépendamment de l’expression du récepteur K5-CD4-GFP par les cellules 293. Le but de cette expérience n’étant pas de déterminer les conditions optimales de la transfection non ciblée des cellules par les protéiplexes formés avec HMGB1, le ratio massique ADNp:HMGB1 et la quantité de protéiplexes n’ont pas été augmentés au-delà des valeurs présentées.

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Figure V-21. Effet du ratio massique et de la quantité de protéiplexes formés avec HMGB1 sur la transfection non ciblée.

Les cellules mixK5 ont été transfectées avec un ratio massique ADNp:HMGB1 croissant (A et B) ou avec une quantité de protéiplexes formés au ratio massique ADNp:HMGB1 (1:5) croissante (C et D). Les cellules ont été traitées avec 100 µM de chloroquine, 30 minpt. L’expression du transgène a été déterminée par quantification du pourcentage de cellules exprimant la BFP par cytométrie en flux, 2 jpt. Les parties A et B, ainsi que les parties C et D représentent deux à deux les mêmes résultats, les parties B et D permettant une meilleure représentation de la corrélation (indiquée sous les lignées cellulaires) entre l’expression relative du transgène et les quantités d’HMGB1 ou de protéiplexes. Les barres d’erreur représentent les erreurs-types des moyennes, n=6. Les flèches indiquent les valeurs de référence qui correspondent aux pourcentages de cellules 293/K5-CD4-GFP exprimant le transgène (BFP) après avoir été transfectées avec un ratio massique ADNp:protéine égal à 1:5 et contenant 1 µg d’ADNp.

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L’évaluation de l’effet de ces augmentations de quantité a alors été déterminée pour la TCHE5 (Figure V-22). Les cellules mixK5 ont été prétraitées pendant 2 j avec 30 mM de NaClO3, puis ont été transfectées avec un ratio massique ADNp:HMGB1-E5

de 1:1 à 1:20 ou avec une quantité croissante de protéiplexes pTT/BFP:HMGB1-E5 au ratio massique 1:5. Les cellules transfectées ont été traitées 30 minpt avec 100 µM de chloroquine et le pourcentage de cellules exprimant le transgène a été déterminé par cytométrie en flux, 2 jpt. Comme pour la figure V-21, les résultats sont exprimés en expression relative comparativement au pourcentage de cellules exprimant la BFP après transfection avec des protéiplexes formés avec un ratio massique pTT/BFP:HMGB1-E5 égal à 1:5 et une quantité de 1 µg d’ADNp a été ajouté par mL de cellules.

Le ratio massique ADNp:HMGB1-E5, entre 1:1 et 1:20 n’a aucun impact sur l’efficacité de transfection, ni sur le ciblage lors de la TCHE5 (Figure V-22 A et B). L’augmentation de la quantité de protéiplexes n’a pas non plus d’impact sur la transfection des cellules exprimant K5-CD4-GFP, par contre elle augmente l’efficacité de transfection des cellules 293 n’exprimant pas K5-CD4-GFP(Figure V-22 C et D). Ainsi l’augmentation de la quantité de protéiplexes lors de la TCHE5 augmente la transfection non ciblée. Afin de s’assurer que HMGB1-E5 n’était pas cytotoxique, les cellules mixK5 ont été prétraitées pendant 2 j avec 30 mM de NaClO3, puis ont été

incubées pendant 2 j supplémentaires avec des quantités croissantes d’HMGB1-E5 seules (Figure V-23 A) ou sous forme de protéiplexes (Figure V-23 B). Les densités et viabilités cellulaires obtenues sont identiques que les cellules aient été incubées en présence ou en l’absence d’HMGB1-E5 seule ou sous forme de protéiplexes. HMGB1-E5 n’a donc pas d’effet délétère sur la croissance cellulaire et ce jusqu’à 20 µg par mL de cellules mixK5.

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Figure V-22. Effet du ratio massique et de la quantité de protéiplexes formés avec HMGB1-E5 sur la transfection ciblée.

Les cellules mixK5 ont été traitées avec 30 mM de NaClO3 pendant 2 j, puis ont été transfectées

avec un ratio massique ADNp:HMGB1-E5 croissant (A et B) ou avec une quantité de protéiplexes formés au ratio massique ADNp:HMGB1-E5 (1:5) croissante (C et D). Les cellules ont été traitées avec 100 µM de chloroquine, 30 minpt. L’expression du transgène a été déterminée par quantification du pourcentage de cellules exprimant la BFP par cytométrie en flux, 2 jpt. Les parties A et B, ainsi que les parties C et D représentent deux à deux les mêmes résultats, les parties B et D permettant une meilleure représentation de la corrélation (indiquée sous les lignées cellulaires) entre l’expression relative du transgène et les quantités d’HMGB1 ou de protéiplexes. Les barres d’erreur représentent les erreurs-types des moyennes, n=6. Les flèches indiquent les valeurs de référence qui correspondent aux pourcentages de cellules 293/K5-CD4-GFP exprimant le transgène (BFP) après avoir été transfectées avec un ratio massique ADNp:protéine égal à 1:5 et contenant 1 µg d’ADNp.

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Figure V-23. Effet de la quantité d’HMGB1-E5 sur la croissance et la viabilité cellulaire.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées avec 30 mM de NaClO3, puis ont été incubées en

présence de quantités croissantes d’HMGB1-E5 seul (A) ou sous forme de protéiplexes (B). Les cellules ont ensuite été numérées grâce à un compteur automatisé de cellules. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes obtenues pour trois échantillons.

2.2.4 Impact de la préformation des protéiplexes sur l’efficacité de