Capture ciblée des protéiplexes

Dans le but de permettre le ciblage du récepteur K5-CD4-GFP par les protéiplexes formés avec HMGB1-E5, il est nécessaire de comprendre l’origine de la capture non ciblée des protéiplexes. Les principaux récepteurs membranaires d’HMGB1 sont : le récepteur RAGE, (Hori et al., 1995)), les récepteurs de type Toll 2 (TLR2, (Curtin et al., 2009)) et 4 (TLR4, (Park et al., 2004)). Les cellules 293 n’expriment pas des niveaux détectables de ces récepteurs (Kang et al., 2009; Kumar Pachathundikandi et al., 2011; Raucci et al., 2008), ils ne sont donc certainement pas responsables de la capture non ciblée des protéiplexes. Toutefois, il a été démontré que HMGB1 peut se lier à l’héparine (Rauvala and Pihlaskari, 1987) et aux héparanes sulfates (Xu et al., 2011). L’utilisation de cellules déficientes en héparanes sulfates, mais sur-exprimant les chondroïtines/dermatanes sulfates (CHO pgsD-677, (Lidholt et al., 1992)), ont déjà permis de démontrer que HMGB1 ne possédait pas la capacité d’interagir avec les chondroïtines et dermatanes sulfates (Xu et al., 2011).

Les cellules mixK5 ont été traitées avec du chlorate de sodium connu pour diminuer la sulfatation, avant d’être transfectées, afin de vérifier si les héparanes sulfates sont impliqués dans la capture non ciblée des protéiplexes. Il était nécessaire de tout d’abord vérifier si le traitement des cellules avec du NaClO3 avait un impact sur leur

viabilité et leur croissance cellulaire (Figure V-11). Le prétraitement des cellules avec des concentrations allant jusqu’à 100 mM de NaClO3 n’affecte pas la viabilité cellulaire.

Toutefois, le chlorate de sodium possède un effet cytostatique (c’est à dire bloque la division cellulaire), de façon concentration dépendante. Il est à noter que l’effet cytostatique du NaClO3 dépend également du nombre de cellules traitées, en effet

lorsque les cellules sont ensemencées à basse densité cellulaire (0,15 × 106 _{cellules/mL),}

l’effet cytostatique commence avec une concentration égale à 30 mM de NaClO3, alors

qu’il faut 40 mM de NaClO3 dans le cas de l’ensemencement à plus haute densité

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Figure V-11. Influence de la concentration en NaClO3 sur la densité et la viabilité cellulaire.

Les cellules mixK5 ont été ensemencées à haute (A, 0,5 × 106 _{cellules/mL) ou basse (B,}

0,15 × 106 cellules/mL) densité cellulaire, puis ont été prétraitées avec des concentrations croissantes en NaClO3. La densité en cellules viables et la viabilité ont été déterminées à l’aide

d’un compteur automatique de cellules, basé sur l’exclusion du bleu trypan. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes de trois expériences réalisées en triplicata, n=9. * valeur-p < 0,05 et ** valeur-p < 0,01, comparativement aux cellules non traitées.

Il a déjà été démontré que le traitement des cellules au NaClO3 inhibe la

transfection par le PEI de façon concentration dépendante (Payne et al., 2007). La sensibilité au chlorate de sodium des cellules 293 exprimant ou non le récepteur K5-CD4-GFP a été vérifiée de manière indirecte, grâce à la détermination de la capture des polyplexes en fonction de la concentration en NaClO3 utilisée pour traiter les

cellules mixK5. La surexpression du récepteur K5-CD4-GFP ne modifie pas la capture des polyplexes vis-à-vis des cellules 293 (Figure V-12 A) et ce pour toutes les concentrations de NaClO3 utilisées. Le pourcentage de cellules ayant capturé les

polyplexes diminue proportionnellement à l’augmentation de la concentration en NaClO3 (Figure V-12 B). Ces résultats suggèrent que la surexpression de K5-CD4-GFP

dans les cellules 293 ne modifie pas la sensibilité des cellules au NaClO3, car la

réduction de capture des polyplexes reflète très probablement la diminution de la sulfatation induite par le traitement au NaClO3. Lors de cette expérience, nous avons

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l’équipe de Payne de façon proportionnelle à la concentration de NaClO3 utilisée pour

traiter les cellules (Payne et al., 2007) était certainement due à une diminution de la capture des polyplexes.

Figure V-12. Effet de la concentration en NaClO3 sur la capture des polyplexes.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées avec des concentrations croissantes de NaClO3, jusqu’à

100 mM, puis ont été transfectées avec des polyplexes formés avec un ratio massique ADNp:LPEI égal à 1:3. La capture des polyplexes contenant le plasmide pTT/BFP marqué avec TOTO-3 par les cellules a été déterminée par cytométrie en flux, 30 minpt. Les parties A et B représentent les mêmes résultats, la partie B permettant une meilleure représentation de la corrélation (indiquée sous les lignées cellulaires) entre la capture des polyplexes et la concentration en NaClO3. Les barres d’erreur représentent les erreurs-types des moyennes de

trois expériences réalisées en triplicata, n=9.

L’implication des groupements sulfates présents sur les HSPGs lors de la capture non ciblée des protéiplexes a ensuite été étudiée. La figure V-13 A montre que le prétraitement des cellules mixK5 avec 10 mM de NaClO3 réduit la capture des

protéiplexes formés avec HMGB1 par un facteur deux (de 26,6 ± 1,2 % à 11,5 ± 1,1 %). L’augmentation de la concentration de NaClO3 à 30 mM permet de réduire au maximum

la capture des protéiplexes formés avec HMGB1 d’un facteur cinq (5,2 ± 0,5 %). La figure V-12 B montre que la capture d’HMGB1-E5 par les cellules 293 suit la même tendance que celle obtenue avec HMGB1 sans le Ecoil. Toutefois, les cellules 293/K5-CD4-GFP continuent à capturer les protéiplexes formés avec HMGB1-E5. Ces résultats montrent que le prétraitement au NaClO3 permet la capture ciblée des

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Figure V-13. Effet de la concentration en NaClO3 sur la capture ciblée des protéiplexes formés avec HMGB1 (A) ou HMGB1-E5 (B).

Les cellules mixK5 ont été prétraitées avec des concentrations croissantes de NaClO3, jusqu’à

50 mM, puis ont été transfectées avec des protéiplexes formés avec un ratio massique ADNp:HMGB1 égal à 1:5. La capture des protéiplexes, contenant le plasmide pTT/BFP marqués avec TOTO-3, a été déterminée 30 minpt, par cytométrie en flux. Les barres d’erreur représentent les erreurs-types des moyennes de trois expériences réalisées en triplicata, n=9. * valeur-p<0,05 et *** valeur-p<0,001 et NS indique une valeur-p non significative.

L’effet du prétraitement des cellules mixK5 avec 30 mM de NaClO3 sur la

capture des protéiplexes formés avec HMGB1-E5 a également été confirmé par microscopie confocale, 4 hpt. La figure V-14 A montre que le prétraitement des cellules avec 30 mM de chlorate de sodium permet d’inhiber la capture des protéiplexes formés avec HMGB1-E5 par les cellules 293 n’exprimant pas le récepteur K5-CD4-GFP et ainsi obtenir une capture ciblée des protéiplexes via le système E/Kcoil, de ce fait la quantité de protéiplexes capturés par cellule exprimant le récepteur est diminuée (Figure V-14 B).

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Figure V-14. Effet du prétraitement des cellules mixK5 avec du NaClO3 sur la capture ciblée des protéiplexes formés avec HMGB1-E5.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées (bas) ou non (haut) avec 30 mM de NaClO3 pendant 2 j,

puis elles ont été transfectées avec des protéiplexes formés avec un ratio massique ADNp:HMGB1-E5 égal à 1:20. Les cellules ont ensuite été traitées avec 100 µM de chloroquine, 30 minpt. La capture des protéiplexes, contenant le plasmide pTT/BFP marqués avec TOTO-3, a été visualisée par microscopie confocale, 4 hpt. Les images de la partie B sont issues de l’agrandissement des encadrés de la partie A. Les flèches indiquent la position des protéiplexes.

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Afin de confirmer que le prétraitement des cellules avec le NaClO3 réduisait bien la

sulfatation, les cellules mixK5 ont été prétraitées avec 30 mM de NaClO3, puis la

quantité de N-sulfates à la membrane cellulaire a été déterminée par cytométrie en flux, à l’aide d’un immunomarquage avec un anticorps reconnaissant un épitope N-sulfaté des héparanes sulfates (l’anticorps 10E4). La figure V-15 montre que l’intensité moyenne de fluorescence par cellule est diminuée par un facteur 4,1 après leur traitement avec 30 mM de NaClO3, ces résultats confirment que le traitement au NaClO3 permet une

diminution des niveaux de sulfatation à la surface cellulaire. Il a déjà été démontré que le traitement au chlorate de sodium avait tout d’abord un impact sur la 6-O-, puis la 2-O- et enfin la N-sulfatation (Safaiyan et al., 1999), il est donc très probable que les niveaux de 2-O- et 6-O-sulfatation soient également réduits. Que les cellules soient traitées ou non avec du chlorate de sodium, le contenu en N-sulfate membranaire des cellules 293 parentales et 293/K5-CD4-GFP est identique, ce qui indique que la surexpression du récepteur n’affecte ni la sulfatation des protéines de la membrane cellulaire, ni la sensibilité des cellules lors du traitement au NaClO3.

Figure V-15. Effet du traitement des cellules avec 30 mM de NaClO3 sur la N-sulfatation au niveau de la membrane cellulaire.

Les cellules ont été prétraitées avec 30 mM de NaClO3 pendant 2 j, puis le niveau de N-sulfatation a

été déterminé par cytométrie en flux, grâce à un immunomarquage avec un anticorps reconnaissant les N-sulfates (10E4).

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1.2.9 Transfection ciblée grâce à la réduction de la sulfatation des