Effet du chlorate de sodium sur l’interaction du récepteur

Avant d’évaluer la capture de la protéine multifonctionnelle ERNKG par les cellules mixK5, nous avons souhaité mieux caractériser l’attachement de la protéine E5-RFP et vérifier si le traitement au NaClO3 avait une influence sur l’interaction du

couple E/Kcoil. Afin de vérifier que la E5-RFP ne s’attachait pas sur la membrane des cellules 293, des quantités croissantes de la protéine E5-RFP, allant de 0,25 à 25 µg ont été ajoutées sur 1 mL de cellules mixK5, non prétraitées avec le NaClO3

(Figure V-48 A). Les cellules mixK5 ont été incubées pendant 30 min avec la E5-RFP, sur glace et sous agitation pour éviter l’internalisation de la protéine et l’agrégation des cellules respectivement. Le pourcentage de cellules possédant une fluorescence rouge, c'est-à-dire attachant la E5-RFP, et la fluorescence rouge moyenne par cellule ont été déterminés par cytométrie en flux. La figure V-48 A montre que la protéine E5-RFP s’attache uniquement sur les cellules qui expriment le récepteur K5-CD4-GFP, ce qui

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indique que la protéine interagit de manière ciblée sur les cellules 293/K5-CD4-GFP via le système E/Kcoil et ce malgré l’utilisation de grandes quantités d’E5-RFP, confirmant les observations effectuées par microscopie confocale (Figure V-6).

L’ajout de quantités croissantes d’E5-RFP sur les cellules mixK5 entraîne une augmentation du pourcentage de cellules interagissant avec la protéine, mais également du nombre de protéines E5-RFP liées par cellule (représenté par la moyenne d’intensité de fluorescence rouge par cellule, MFI). L’évolution de la quantité d’E5-RFP s’attachant sur les cellules 293/K5-CD4-GFP a donc été déterminée, grâce à la multiplication du pourcentage de cellules présentant une fluorescence rouge par l’intensité moyenne de fluorescence rouge des cellules (% × MFI). L’influence du traitement au NaClO3 a été évaluée par la comparaison de la quantité d’E5-RFP

s’attachant sur les cellules mixK5 traitées ou non avec 30 mM de NaClO3

(Figure V-48 B). La quantité d’E5-RFP liée sur les cellules 293/K5-CD4-GFP augmente lorsque la quantité de protéines incubée avec les cellules est augmentée de 0,25 µg à 5 µg, toutefois la quantité d’E5-RFP attachée sur les cellules exprimant K5-CD4-GFP atteint un plateau lorsque 10 µg d’E5-RFP ont été ajoutés indiquant que les sites de liaison K5 sont saturés, et ce que les cellules soient traitées ou non avec le chlorate de sodium. Lorsque moins de 5 µg d’E5-RFP a été ajouté à 1 mL de cellules mixK5, les cellules 293/K5-CD4-GFP ayant été traitées avec le chlorate de sodium attachent légèrement plus d’E5-RFP que les cellules non traitées. Par contre, cette différence d’attachement disparait quand la quantité d’E5-RFP est augmentée. Ces résultats suggèrent que le traitement au chlorate de sodium, qui réduit la sulfatation des protéines de la surface cellulaire faciliterait l’attachement d’E5-RFP sur le récepteur K5-CD4-GFP. À la fin de cette expérience, les cellules ont été imagées par microscopie confocale afin de confirmer la non internalisation d’E5-RFP (Figure V-49).

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Figure V-48. Effet du traitement au NaClO3 sur l’attachement de la protéine E5-RFP sur les cellules mixK5.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées ou non avec 30 mM de NaClO3 pendant 2 j, puis elles ont

été incubées, sur glace, avec des quantités croissantes d’E5-RFP (de 0,25 à 25 µg) pendant 30 min. Le surnageant cellulaire contenant la protéine E5-RFP libre a été enlevé et les cellules ont été lavées et resuspendues dans du DPBS. L’attachement d’E5-RFP a été déterminé par cytométrie en flux. Le panneau A représente le pourcentage de chaque lignée cellulaire, non traitées au NaClO3, ayant lié la E5-RFP et le panneau B représente la quantité d’E5-RFP

attachée sur les cellules 293/K5-CD4-GFP traitées ou non avec du chlorate de sodium (déterminée par la multiplication du pourcentage de cellules ayant une fluorescence rouge par la moyenne de l’intensité de fluorescence rouge par cellule). Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes, n=3. *** valeur-p<0,001 entre les quantités de E5-RFP liées avec et sans traitement au NaClO3 (30 mM).

Figure V-49. Vérification de l’absence d’internalisation d’E5-RFP lors des expériences d’attachement sur les cellules 293/K5-CD4-GFP.

Les cellules 293/K5-CD4-GFP ont été incubées avec 25 µg d’E5-RFP pendant 30 min sous agitation et sur glace, puis le surnageant cellulaire contenant la protéine E5-RFP libre a été enlevé et les cellules ont été lavées et resuspendues dans du DPBS. Les cellules ont été conservées sur la glace avant et pendant l’analyse de l’attachement de la E5-RFP par cytométrie en flux, puis à la fin de l’expérience les cellules ont été visualisée par microscopie confocale.

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L’effet du traitement des cellules mixK5 avec 30 mM de NaClO3 sur

l’interaction d’E5-RFP avec le récepteur K5-CD4-GFP a également été évalué par microscopie confocale. La partie fluorescente du récepteur K5-CD4-GFP est située dans la cellule, alors que la protéine E5-RFP s’attache à l’extérieur des cellules, afin d’éviter d’avoir une membrane entre les deux fluorochromes, le récepteur K5-CD4-GFP a été détecté par l’utilisation d’un anticorps anti-CD4 couplé à l’Alexa 405. De plus, les cellules 293/K5-CD4-GFP contiennent de grandes quantités de récepteurs intracellulaires (Figure V-6), qui sont probablement en court de synthèse, l’anticorps anti-CD4 permet un marquage des récepteurs uniquement lorsque ceux-ci sont présents à la surface des cellules, car les cellules n’ont pas été perméabilisées. Les cellules mixK5, prétraitées ou non avec 30 mM de chlorate de sodium, ont été incubées en présence d’E5-RFP et de l’anticorps anti-CD4 pendant 30 min, puis ont été fixées avec 4 % de PFA diluée dans du PBS, ensuite les cellules ont été centrifugées à l’aide d’un cytospin c'est-à-dire centrifugées sur une lame de verre, puis les cellules ont été imagées par microscopie confocale. Les coefficients de colocalisation de Pearson et Manders M1 (comparant la fluorescence de l’anticorps anti-CD4 à celle d’E5-RFP) et M2 (comparant la fluorescence d’E5-RFP et celle de l’anticorps anti-CD4) calculés sont identiques, que les cellules aient été prétraitées ou non avec le NaClO3. Les coefficients de Pearson,

Manders M1 et M2 sont d’environ 0,82, 0,90 et 0,99 respectivement. Le coefficient de Manders M2 est très proche de 1, ce qui indique que quasiment toutes les protéines E5-RFP sont colocalisées avec le récepteur K5-CD4-GFP, alors que le coefficient de Manders M1 est légèrement inférieur suggérant que certains récepteurs n’ont pas lié la E5-RFP.

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Figure V-50. Effet du traitement au NaClO3 sur la colocalisation du récepteur K5-CD4-GFP et de la protéine E5-RFP.

Les cellules mixK5 ont été incubées pendant 30 min avec 10 µg d’E5-RFP par million de cellules et un anticorps reconnaissant la partie extracellulaire du récepteur CD4 après que les cellules aient été traitées ou non avec 30 mM de NaClO3. Les cellules ont ensuite été fixées

avec 4 % de PFA diluée dans du PBS, suivi de leur dépôt sur une lame de verre à l’aide d’un cytospin. La colocalisation de l’anticorps anti-CD4 et de la protéine E5-RFP a été analysée avec le logiciel Volocity sur des images prises avec un microscope confocal. Le nombre de cellules 293/K5-CD4-GFP analysées était de 32 et 27 respectivement pour les cellules non traitées et traitées avec 30 mM de chlorate de sodium.

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5.2.3 Affinité de liaison de la E5-RFP sur les cellules